PROTEOSYNTEZA

  Druhý nukleotid U C A G První nukleotid UUU fenyalanin UCU serin UAU tyrosin UGU cystein Třetí nukleotid UUC fenyalanin UCC serin UAC tyrosin UGC cystein UUA leucin UCA serin UAA stop kodon UGA stop kodon UUG leucin UCG serin UAG stop kodon UGG tryptofan CUU leucin CCU prolin CAU histidin CGU arginin CUC leucin CCC prolin CAC histidin CGC arginin CUA leucin CCA prolin CAA glutamin CGA arginin CUG leucin CCG prolin CAG glutamin CGG arginin AUU isoleucin ACU threonin AAU asparagin AGU serin AUC isoleucin ACC threonin AAC asparagin AGC serin AUA isoleucin ACA threonin AAA lysin AGA arginin AUG methionin ACG threonin AAG lysin AGG arginin GUU valin GCU alanin GAU kyselina asparagová GGU glycin GUC valin GCC alanin GAC kyselina asparagová GGC glycin GUA valin GCA alanin GAA kyselina glutamová GGA glycin GUG valin GCG alanin GAG kyselina glutamová GGG glycin Terminační kodony Terminační kodony Terminační kodony Iniciační kodon Kodon AUG slouží jako tzv. iniciační kodon (signalizuje začátek translace) a také jako kodon, ke kterému je přiřazen methionin. Kodony UAA, UAG a UGA se nazývají terminační někdy též stop kodony. Terminační kodony signalizují konec kódující sekvence. Ze 64 možných tripletů: 61 určuje aminokyseliny + 3 určují terminaci translace

tRNA Kodony v mRNA nerozpoznávají přímo aminokyseliny, které specifikují. Translace mRNA do proteinu závisí na tRNA (transferová RNA), která je schopna jednou částí molekuly rozpoznat a spárovat se s kodonem v mRNA a jinou částí vázat aminokyselinu. Touto částí váže příslušné aminokyseliny Touto částí se páruje s kodonem v mRNA Obr. 1. Struktura tRNA

Struktura tRNA Jedna z částí tRNA se nazývá antikodon, což jsou tři nukleotidy komplementární ke kodonu v mRNA. Další důležitou oblastí je 3'-konec (vždy končí sekvencí CCA), na který je navázána příslušná aminokyselina. Obr. 1. Struktura tRNA 3'-konec tRNA tRNA se váže antikodonem ke kodonu na mRNA.

Struktura jetelového listu Struktura tRNA Molekuly tRNA jsou všechny přibližně 80 nukleotidů dlouhé. Jejich struktura připomíná jetelový lístek, který podléhá ještě dalšímu sbalení a vytváří konečnou strukturu ve tvaru písmene L. Tento snímek je možné při výuce středoškolské biochemie vynechat či zařadit do semináře. Skutečný L-tvar tRNA Struktura jetelového listu Obr. 2. L-tvar tRNA

Aminoacyl-tRNA-synthetasa Rozpoznání a připojení správné aminokyseliny je funkcí enzymů nazývaných aminoacyl-tRNA-synthetasy. A C Aminokyselina (Tryptofan) tRNA Snímky č. 10 – 12 týkající se aminoacyl-tRNA-synthetasy je možné při výuce středoškolské biochemie vynechat či zařadit do semináře. Specifické nukleotidy v obou ramenech, antikodonovém i vázajícím aminokyselinu, umožňují rozpoznání každé tRNA vlastní aminoacyl-tRNA-synthetasou. Aminoacyl-tRNA-synthetasa Obr. 3. Aminoacyl-tRNA-synthetasa

Aminoacyl-tRNA-synthetasa Reakce katalyzovaná aminoacyl-tRNA-synthetasou vyžaduje dodání energie hydrolýzou ATP. Aminokyselina (Tryptofan) A C ATP AMP + 2Pi Vazba aminokyseliny k tRNA tRNA A C Snímky č. 10 – 12 týkající se aminoacyl-tRNA-synthetasy je možné při výuce středoškolské biochemie vynechat či zařadit do semináře. Aminoacyl-tRNA-synthetasa Obr. 3. Aminoacyl-tRNA-synthetasa

Aminoacyl-tRNA-synthetasa Při této reakci vzniká vysokoenergetická (makroergická) „vazba“ mezi tRNA a aminokyselinou. Tato energie je později využita pro tvorbu kovalentní vazby mezi rostoucím polypeptidovým řetězcem a nově navázanou aminokyselinou. A C Aminoacyl-tRNA-synthetasa ATP AMP + 2Pi Vazba aminokyseliny k tRNA Makroergická vazba Aminokyselina (Tryptofan) U G Vazba kodonu k antikodonu Párování bází mRNA 5' 3' tRNA Snímky č. 10 – 12 týkající se aminoacyl-tRNA-synthetasy je možné při výuce středoškolské biochemie vynechat či zařadit do semináře. Obr. 3. Aminoacyl-tRNA-synthetasa

Ribozomy prokaryot a eukaryot Velikosti ribozomů se často vyjadřují podle rychlosti sedimentace (Svedbergovy jednotky "S"). Prokaryota: velikost 70S (20 x 25 nm) malá podjednotka 30S: rRNA 16S + 21 polypeptidů velká podjednotka 50S: rRNA 5S a 23S + 31 polypeptidů Eukaryota: obvyklá velikost 80S (určitá mezidruhová variabilita) v mitochondriích a chloroplastech 60S malá podjednotka 40S: rRNA 18S + 33 polypeptidů velká podjednotka 60S: rRNA 5S, 5.8S, 28S + 49 polypeptidů

Translace probíhá na ribosomech Ribosom obsahuje čtyři vazebná místa pro molekuly RNA: jedno pro mRNA a tři pro tRNA (E-místo, A-místo, P-místo). E-místo P-místo A-místo Velká ribosomální jednotka Malá P A E Vazebné místo pro mRNA A (aminoacylové): váže aminoacyl-tRNA P (peptidylové): váže tRNA, ke které je připojen rostoucí polypeptidový řetězec E (místo exitu): váže tRNA zbavenou AK před opuštěním ribozomu Obr. 4. Model Ribosomu Malá podjednotka zodpovídá za nasednutí tRNA na kodon mRNA. Velká podjednotka katalyzuje vznik peptidové vazby mezi aminokyselinou a polypeptidovým řetězcem.

Translace probíhá na ribosomech Obě podjednotky se spojují na molekule mRNA obvykle blízko jejího 5'-konce a zahajují syntézu proteinu. E-místo P-místo A-místo Velká ribosomální jednotka P A E Malá ribosomální jednotka Vazebné místo pro mRNA Obr. 4. Model Ribosomu Ribosom se pohybuje podél mRNA, překládá nukleotidovou sekvenci do aminokyselinové za použití tRNA a po dosyntetizování proteinu se obě jednotky opět oddělí.

Obr. 5. Iniciace translace Met Translace začíná na iniciačním kodonu AUG a pro iniciaci je třeba iniciační tRNA, která má na sobě vázaný methionin (u bakterií formyl-methionin). iniciační tRNA, která má na sobě vázaný methionin U eukaryot je iniciační tRNA s navázaným methioninem připojená k malé ribosomální jednotce za asistence několika tzv. iniciačních faktorů. Malá ribosomální podjednotka Na mRNA je červeně znázorněný iniciační kodon AUG. Na čtyřech snímcích řazených za sebou je stručně popsána a zanimována část průběhu iniciace translace. Pomocí pohyblivých tvarů je docíleno konkrétnosti a pochopení návaznosti. Malá ribosomální podjednotka se i s navázanou iniciační tRNA naváže na 5'-konec mRNA. Po rozpoznání iniciačního kodonu se připojí velká podjednotka. mRNA 5' 3' AUG Obr. 5. Iniciace translace

Obr. 5. Iniciace translace Po navázání iniciační tRNA se malá podjednotka váže na 5'-konec mRNA a začne se pohybovat podél mRNA ve směru 5' → 3' a hledat první kodon AUG, který je rozpoznán antikodonem iniciační tRNA. Met mRNA 5' 3' AUG Obr. 5. Iniciace translace

Obr. 5. Iniciace translace Po navázání iniciační tRNA se malá podjednotka váže na 5'-konec mRNA a začne se pohybovat podél mRNA ve směru 5' → 3' a hledat první kodon AUG, který je rozpoznán antikodonem iniciační tRNA. E P A Po rozpoznání iniciačního kodonu se od malé ribosomální podjednotky odpoutá několik iniciačních faktorů, což umožní připojení velké ribosomální podjednotky. Velká ribosomální podjednotka Iniciační tRNA se váže rovnou do P-místa, proto prodlužování řetězce může ihned začít navázáním druhé tRNA s aminokyselinou do A-místa. Met E P A Met mRNA 5' 3' AUG AUG AUG Obr. 5. Iniciace translace

Obr. 5. Iniciace translace Po navázání iniciační tRNA se malá podjednotka váže na 5'-konec mRNA a začne se pohybovat podél mRNA ve směru 5' → 3' a hledat první kodon AUG, který je rozpoznán antikodonem iniciační tRNA. aa2 Po rozpoznání iniciačního kodonu se od malé ribosomální podjednotky odpoutá několik iniciačních faktorů, což umožní připojení velké ribosomální podjednotky. Iniciační tRNA se váže rovnou do P-místa, proto prodlužování řetězce může ihned začít navázáním druhé tRNA s aminokyselinou do A-místa. E P A Met AUG mRNA 5' 3' Obr. 5. Iniciace translace

Obr. 5. Iniciace translace V dalším kroku dochází ke vzniku peptidové vazby mezi methioninem a přicházející aminokyselinou (aa2). Met aa2 E P A 5' 3' AUG mRNA Obr. 5. Iniciace translace

Iniciace translace V dalším kroku dochází ke vzniku peptidové vazby mezi methioninem a přicházející aminokyselinou (aa2). Ribosom se posune o 3 nukleotidy podél mRNA. tRNA bez navázané aminokyseliny se uvolní z E-místa a tRNA z A-místa se přenese do P-místa. Met aa2 E P A 5' 3' AUG mRNA Obr. 5. Iniciace translace

Elongace translace (prodlužování řetězce) Při proteosyntéze je neustále opakován tříkrokový cyklus: V prvním kroku je aminoacyl-tRNA navázána do A-místa. aa4 Na třech snímcích řazených za sebou je zanimován pomocí pohyblivých objektů průběh elongace translace, během které dochází k prodlužování peptidového řetězce. NH2 aa1 aa2 aa3 E P A 5' 3' mRNA Obr. 6. Elongace translace

Elongace translace (prodlužování řetězce) Při proteosyntéze je neustále opakován tříkrokový cyklus: V prvním kroku je aminoacyl-tRNA navázána do A-místa. Ve druhém kroku dochází ke vzniku peptidové vazby mezi prodlužujícím se řetězcem a přicházející aminokyselinou. aa3 aa2 aa1 NH2 aa4 E P A 5' 3' mRNA Obr. 6. Elongace translace

Elongace translace (prodlužování řetězce) Při proteosyntéze je neustále opakován tříkrokový cyklus: V prvním kroku je aminoacyl-tRNA navázána do A-místa. Ve druhém kroku dochází ke vzniku peptidové vazby mezi prodlužujícím se řetězcem a přicházející aminokyselinou. Ve třetím kroku se ribosom posune o 3 nukleotidy podél mRNA. tRNA bez navázané aminokyseliny se uvolní z E-místa a tRNA z A-místa se přenese do P-místa. aa3 aa2 aa1 NH2 aa4 E P A 5' 3' mRNA Obr. 6. Elongace translace

Elongace translace (prodlužování řetězce) Vazba tRNA s připojenou aminokyselinou do volného A-místa (1. krok elongace). Vznik peptidové vazby (2. krok elongace). Posun chromosomu a uvolnění volné tRNA (3. krok elongace). aa5 aa3 aa2 aa1 NH2 aa4 aa5 E P A 5' 3' mRNA Obr. 6. Elongace translace

Elongace translace (prodlužování řetězce) 5' 3' mRNA aa4 aa3 aa2 aa1 NH2 aa5 tRNA Rostoucí peptidový řetězec Posun o tři nukleotidy Elongace translace (prodlužování řetězce) mRNA je překládána ve směru 5' → 3' a nejprve vzniká N-konec proteinu. Celý cyklus všech tří kroků je opakován při každém předávání nové aminokyseliny do polypeptidového řetězce, dokud ribosom nenarazí na stop-kodon. Polypeptidový řetězec roste směrem od N-konce k C-konci. Obr. 7. Elongace translace (Schéma)

Terminace translace Konec proteinu je signalizován přítomností jednoho ze tří terminačních neboli stop kodonů (UAA, UAG nebo UGA). Těmto kodonům není přiřazená žádná aminokyselina. Místo tRNA se na stop kodon v A-místě vážou tzv. terminační faktory, které mění aktivitu peptidyltransferasy tak, že místo aminokyseliny použije molekulu vody pro uvolnění karboxylového konce hotového polypeptidového řetězce z tRNA v P-místě. Uvolňovací faktor NH2 Na třech snímcích řazených za sebou je pomocí pohyblivých objektů zanimován průběh terminace translace. K tomuto procesu dochází, jakmile se na mRNA objeví terminační kodon (na obrázku je červeně znázorněný terminační kodon UAA). aa1 aa3 aa2 E P A aa4 aa5 5' 3' UAA mRNA Obr. 8. Terminace translace

Terminace translace Konec proteinu je signalizován přítomností jednoho ze tří terminačních neboli stop kodonů (UAA, UAG nebo UGA). Těmto kodonům není přiřazená žádná aminokyselina. Místo tRNA se na stop kodon v A-místě vážou tzv. terminační faktory, které mění aktivitu peptidyltransferasy tak, že místo aminokyseliny použije molekulu vody pro uvolnění karboxylového konce hotového polypeptidového řetězce z tRNA v P-místě. H2O NH2 aa5 aa4 aa3 aa2 aa1 COOH NH2 aa5 aa4 aa3 aa2 aa1 Protein se uvolňuje do cytoplasmy. E P A 5' 3' mRNA UAA Obr. 8. Terminace translace

Obr. 8. Terminace translace Po skončení proteosyntézy je mRNA odpojena od ribosomu a dojde k disociaci obou podjednotek ribosomu, které se mohou navázat na jinou molekulu mRNA a začít novou transkripci. E P A 5' 3' UAA mRNA Obr. 8. Terminace translace

E P A mRNA E P A E P A 5' 3' 5' 3' mRNA 5' 3' Obr. 9. Iniciace, aa AUG mRNA Malá ribosomální podjednotka s navázanými iniciačními faktory Vazba na mRNA Met Velká ribosomální podjednotka Aminoacyl-tRNA Vznik peptidové vazby E P A 5' 3' mRNA aa4 aa3 aa2 aa1 NH2 aa5 tRNA Rostoucí peptidový řetězec Posun o tři nukleotidy E P A aa5 aa4 aa3 aa2 aa1 NH2 5' 3' UAA COOH Uvolňovací faktor H2O Obr. 9. Iniciace, elongace, a terminace translace