Histologická technika D. Kylarová

cytologické vyšetření Způsoby vyšetření cytologické vyšetření histologické vyšetření biopsie exfoliativní cytologie aspirační cytologie

Cytologický preparát

Histologický preparát

Zpracování tkání - histologie Odběr Fixace Krájení tkáně prosycené parafínem zmrzlé tkáně Barvení

Odběr Biopsie Punkce Excize Kyretáž Peroperační biopsie Nekropsie Postup: Oddělení vzorku - velikost tkáňového bločku max 1cm2 Oplach va fyziologickém roztoku Vložení do fixační tekutiny - ihned po odběru !!! Označení vzorku

Fixace Def.: rychlá a šetrná denaturace bílkovin bránící autolýze tkání Podmínky fixace Rychlost - odběr, průnik, velikost vzorku (1cm2, 1mm2) Zachování struktury Barvitelnost Fixace fyzikální Fixace chemická – fix. tekutiny:

Fixační tekutiny formaldehyd (10% formol, neutrální nebo pufrovaný) Bouinova t. (formol + k. pikrová) Zenkerova t. (dvojchroman draselný, sublimát, formol) metacarn (formol, metanol, voda) oxid osmičelý, glutaraldehyd

Krájení parafínových řezů Odvodnění - vzestupná etanolová řada Projasnění - xylen Prosycení parafínem Zalití do parafínu Krájení na mikrotomu (tloušťka řezu 4-10mm Rotační x sáňkový mikrotom Lepení řezů na podložní skla

ODVODNĚNÍ ŘEZŮ

XYLEN

PROSYCENÍ PARAFINEM I

PROSYCENÍ PARAFINEM II

ZALÉVÁNÍ II

ZALÉVÁNÍ III

Krájení zmrazených tkání Zmrazovací mikrotom, kryostat Použití: Peroperační biopsie Průkaz enzymů Barvení tuků Imunohistochemie

Barvení parafínových řezů HE Odparafínování Zavodnění Barvení hematoxylinem Praní v tekoucí vodě Barvení eosinem Odvodnění Projasnění Montování

Elektronová mikroskopie Transmisní elektronový mikroskop Princip: emitované elektrony procházejí preparátem, po jejich dopadu na fluorescenční stínítko vzniká obraz (obdoba SM) Zpracování tkáně Odběr (supravitální, velikost vzorku max 1mm2) Fixace dvoustupňová (glutaraldehyd, OSO4) Odvodnění (aceton) Prosycení (směs epox. pryskyřice s tužidlem) Vytvrzení a zalití (epoxidové pryskyřice, metakryláty) Krájení (ultramikrotomy – 30 – 60nm) Přenesení na nosné terčíky Kontrastování (uranyl acetát)

Elektronová mikroskopie Polotenké řezy Řezy krájené na ultramikrotomu za účelem prohlížení v SM Využití - orientace v bloku před vyšetřením v TEM - studium cytologických detailů v SM (!Fixace!) řezy silné 0,5-1mm se přenesou na podložní sklo a barví se roztokem toluidinové modři (popř. azur…)

Elektronová mikroskopie Rastrovací elektronový mikroskop Princip: úzký svazek elektronů projíždí preparát, odražené elektrony na stínítku dávají plastický obraz Zpracování tkáně Odběr (může být i větší vzorek než pro TEM) Fixace Odvodnění (šetrné vysušení za zvýšeného tlaku a teploty) u tvrdých tkání (zub, kost) tento bod vynecháme Pokovení (naprášení kovových častic na povrch) Rozlišovací schopnost do 300 000x

Díky za pozornost 