Isolace enzymů

Proč isolovat enzymy? Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy  degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory  snížení aktivity cílových enzymů) V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové preparáty (např. medicina  urokinasa, streptokinasa ...)

Zdroje enzymů Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny Selekce optimálních producentů (maximální produkce enzymu, optimální vlastnosti enzymu, snadné získání producenta, snadnost purifikačního postupu ...) Selekce bakteriálních producentů amylas

Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru ...) - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy (produkce enzymů s vyšší teplotní stabilitou)

Živočišné zdroje Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci Jateční zvířata – orgány, krev Člověk – tělní tekutiny (krev  plasmin, thrombin ...; moč  urokinasa ...) Bezobratlí (hmyz, plži, mlži  málo se využívají)

Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda – problematický růst za definovaných podmínek

Problémy se vzorkem Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných bílkovin a jiných látek) Malá množství cílového enzymu Labilita enzymu

Zásady pro práci s biologickým materiálem Pokud možno zpracovat co nejdříve V případě potřeby zmrazit (– 60 – 80 oC) Rozmrazování – co nejrychleji Nízká teplota při isolaci Vhodné pH + iontová síla Vhodná koncentrace bílkoviny Zabránění pěnění Omezení nežádoucí proteolytické aktivity Přídavek specifických látek (např. merkaptoethanol, EDTA ...)

Cíl izolace Získání homogenní bílkoviny Zachování biologické aktivity Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného (optimálního) úsilí

Distribuce enzymů Intracelulární V periplasmatickém prostoru Extracelulární cytoplasma periplasma

Membránově vázané bílkoviny

Úprava biologického materiálu Mletí (kulový mlýnek, masový strojek) Homogenizace (rozmělnění biologického materiálu v pufru) - Elvehjem-Potterův homogenizátor - třecí miska s pískem - výkonný mixer

Dezintegrace mikrobiálních buněk Narušení buněčné stěny Způsoby – fyzikální - chemické - enzymové

Fyzikální způsoby dezintegrace Třecí miska + balotina, písek ... Střídavé zmražování a roztávání French press (protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) Ultrazvuk Mlýnek se skleněnými balotinami X-press

Chemické způsoby dezintegrace Acetonová sušina (homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu) Osmotická lyse  erytrocyty (suspenze v hypotonickém prostředí) Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány) Přídavek toluenu (toluen extrahuje při 35 – 40 oC fosfolipidy buněčné stěny  osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu)

Enzymové způsoby dezintegrace Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem)  rozrušení buněčné stěny bakterií (zejména G+), následné zředění destilovanou vodou

Metody isolace enzymů Srážení (precipitace) Membránové separační procesy Chromatografie Elektroforéza

Srážení Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4 Filtrace nahrazena centrifugací

Vysolování vsolování vysolování

(NH4)2SO4 Rozpustnost se málo mění s teplotou Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) Levný Stabilizuje bílkoviny Relativně čistý

Srážení - dvojstupňově

Provedení pevný (NH4)2SO4 nebo saturovaný roztok (NH4)2SO4 Chlazení Míchání 10-30’ Centrifugace úprava pH NH4OH El. míchačka

Srážení organickými rozpouštědly Kompletně mísitelné s vodou Nereagují s bílkovinou Musí mít dobrý precipitační efekt Srážení za nízké teploty (< 0 °C)!!! Možné dvoustupňové srážení EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan

Srážení organickými polymery a sloučeninami Princip identický jako srážení s rozpouštědly DEAE dextran PEG Polyakrylová kyselina Rivanol (2-ethoxy-6,9-diaminoakridinlaktát) Kaprylová kyselina

Srážení selektivní denaturací Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina (enzym) musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla Balastní bílkovina musí nejen denaturovat, ale i precipitovat

Tepelná denaturace Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno Při vyšší teplotě může více probíhat proteolýza

Membránové separační metody Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul Membránová filrace (ultrafiltrace)  rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí). Probíhá za vyššího tlaku Dialýza  difuze nízkomolekulárních látek membránou; oddělením solí po vysolování bílkovin

Ultrafiltrace Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit

Odstranění nízkomolekulárních složek Dialýza

Chromatografické metody – základní rozdělení Distribuce složek mezi dvěma fázemi  mobilní a stacionární fáze Mobilní fáze  kapalina (kapalinová chromatografie); plyn (plynová chromatorafie) Stacionární fáze  částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na pevných částicích, kapalina v pórech chromatografického nosiče, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní Nejčastěji sloupcová chromatografie Nízkotlaká, střednětlaká (FPLC) a vysokotlaká (HPLC) chromatografie

Instrumentace pro LPC Pumpa – peristaltická nebo gravitace Gradient – mísič gradientu Dávkování – přímo pumpou na kolonu Kolony – skleněné Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm Vyhodnocování – zapisovač Sběrač frakcí – programovatelný

Částice sorbentu

Chromatografické metody pro separaci proteinů Gelová chromatografie Ionexová chromatografie Chromatografie s hydrofóbní interakcí Afinitní chromatografie

Gelová chromatografie Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru Rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu  nemísitelnost s mobilní fází Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později Isokratická eluce Objem vzorku < 2 % objemu kolony Chromatografické materiály  zesítěný dextran (Sephadex), agarosa, polyakrylamid Možnost stanovení molekulových hmotností Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

Gelová permeační chromatografie

Gelová permeační chromatografie Pořadí eluce : největší>střední>nejmenší molekula

Ionexová chromatografie Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje V případě proteinů hraje zásadní roli pH ! Celulosové a dextranové ionexy

Ionexy Katexy – záporný náboj  vazba kationtů silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO- Anexy – kladný náboj  vazba aniontů slabé – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE)

Ionexová chromatografie proteinů Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou chromatografii

Ionexová chromatografie Nanášení vzorku – nízká iontová síla Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

Typická ionexová chromatografie Loading ends, Low salt wash begins Salt gradient Protein absorbance II III Salt gradient ends Salt gradient begins Peak of unbound protein Loading starts I Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins

Chromatografie s hydrofobní interakcí Proteiny mají na svém povrchu hydrofóbní skupiny  intreakce s chromatografickými nosiči, které nesou hydrofóbní skupiny (oktyl, fenyl) Nebezpečí denaturace proteinu (v případě silné vazby) Interakci podporuje vysoká iontová síla

Hydrofobní chromatografie Stacionární fáze – - C8, -fenyl Mobilní fáze – vodné roztoky s vysokou koncentrací solí (např. 1.7 M (NH4)2SO4) Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace a zakoncentrování bílkovin, možno použít přímo po vysolování síranem amonným

Afinitní chromatografie - princip Využití schopnosti biologicky aktivních látek specificky rozpoznat jinou molekulu  látky mají k sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické) Typ adsorpční chromatografie využívající specifické interakce Látka navázaná na nosič  afinitní ligand Vazba ligandu přes raménko (spacer)

Předpoklady pro vznik komplexu Sterické – použití raménka (spacer) Optimální pH, iontová síla

Předpoklady pro vznik komplexu Vazebné Konformační

Afinitní páry

Interakce mezi DNA a endonukleasou

Afinitní chromatografie 1. Analog substrátu Afinitní ligand Enzym + Nosič Raménko Enzym vázaný v aktivním místě 2. Imunoafinitní chromatografie Protilátka Proteinový epitop + Nosič Raménko Enzym vázaný na protilátku

Provedení Nanesení vzorku – nízká iontová síla Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : purifikace a zakoncentrování proteinů (i jednostupňová)

Chromatografie na imobilizovaných barvivech Dye-binding chromatografie Reaktivní barviva vázaná na chromatografických nosičích Barviva částěčně podobná některým kofaktorům Isolace enzymů i neenzymových bílkovin (např. albumin)

Metal chelate chromatografie Chelatující skupiny navázané na chromatografické nosiče  vazba iontů těžkých kovů (např. Ni2+) Interakce kovových iontů s exponovanými histidylovými zbytky na povrchu molekuly proteinu Isolace rekombinantních proteinů s His6 částí

Chromatofokusace Použití ionexových chromatografických materiálů pro separaci podle isoelektrických bodů Kolona s vhodným ionexem je ekvilibrována v pufru o vysokém pH (vyšší než IEB cílové bílkoviny), vzorek je nanesen v témže pufru, poté je kolona promývána pufrem o nízkém pH obsahujícím amfolyty. Při průchodu pufru s amfolyty kolonou se vytváří pohybující se gradient pH. Proteiny se v koloně rozdělují podle hodnot isoelektrického bodu.

Magnetické separační techniky Imobilizace afinitních ligandů nebo iontově výměnných skupin na magnetické nosiče Magnetické sorbenty připravené z biopolymerů vykazujících specifitu k cílovému proteinu Vsádková separace cílových proteinů Výhoda – možnost práce v obtížně manipulovatelných systémech (např. suspenze kultivační média, homogenáty buněk ...) Možnost isolace cenných biologicky aktivních látek ze sekundárních surovin (odpadů) BioMagn. Res. Technol. 2 (2004) 7 http://www.biomagres.com/content/pdf/1477-044X-2-7.pdf

Základní zásady Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením  velké množství levného vstupního materiálu Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná  ve vzorku již investovaná práce, množství cílového proteinu je menší Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace  možné snížení výtěžku) Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu

Základní zásady (typické příklady) Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku)  chromatografie s hydrofóbní interakcí Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou)  chromatografie s hydrofóbní interakcí Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů)

Nevhodné kombinace Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok  dialýza, ultrafiltrace)

Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt 100 1 - 100 % HIC 50 99 1.99 99 % IEX 25 75 3 3.0 75 %

Elektroforesa Proteiny se pohybují v nosiči (obvykle polyakrylamidový gel) vlivem elektrického pole Pohyb proteinu závisí na Náboji proteinu a jeho molekulové hmotnosti Intenzitě elektrického pole Typu a porozitě gelu Různé typy (PAGE, SDS-PAGE) Význam: kontrola čistoty separovaného proteinu

PAGE elektroforesa Polyakrylamid o různé velikosti pórů použit jako nosič Proteiny jsou rozpuštěny v zásaditém pufru V elektrickém poli se proteiny pohybují směrem k anodě

SDS elektroforesa SDS denaturuje všechny typy proteinů Váže se na proteiny v konstantním poměru (1 molekula SDS na 2 aminokyselinové zbytky) všechny proteiny získají vysoký záporný náboj separace probíhá pouze podle velikosti molekulové hmotnosti

Sledování čistoty proteinů Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou hmotnost isolovaného proteinu (SDS elektroforesou) Nenavázané proteiny Eluované proteiny Původní vzorek Standardy