Měření optické aktivity 4.4 Vibrační cirkulární dichroismus Přednáška 4 Měření optické aktivity 4.4 Vibrační cirkulární dichroismus 4.5 Fluorescenčně detekovaný cirkulární dichroismus (FDCD) 4.6 Magnetická optická aktivita (MOA) 4.7 Cirkulárně polarizovaná luminiscence CH M 2013 přednáška 4

4.4 Vibrační cirkulární dichroismus Komerčně dostupné spektrometry VCD - založené na IR spektrometru s FT Schéma optické a elektronické části FTIR spektrometru Intenzitní (amplitudová) modulace s fFT (DC) amplitud. modulace s fPEM (AC)+ amplitud. modulace s fFT (DC) FTIR spektrometr CH M 2013 přednáška 4

=IAC/IDC 2.3 Vibrační cirkulární dichroismus Komerčně dostupné spektrometry VCD - založené na FTIR spektrometru Schéma optické a elektronické části FTIR spektrometru amplitud. modulace fPEM (AC)+ amplitud. modulace fFT (DC) =IAC/IDC CH M 2013 přednáška 4

Celkové schéma FTIR spektrometru CH M 2013 přednáška 4

Experimentální podmínky ve spektroskopii VCD Spektrální omezení materiál speciálních optických elementů (PEM) oborem citlivosti detektoru 900-1800 cm-1: MCT, chlazený kapalným dusíkem 4000-6000 cm-1: InGaAs, pokojová teplota 2000-4000 cm-1: MCT, termoelektricky chlazený, InSb chlazený kapalným dusíkem 5000-9000 cm-1: Ge, pokojová teplota nejdostupnější oblast 2000 – 800 cm-1 Dynamický rozsah A=0,1-1, optimální 0,4 - 0,6 Dosahuje se kombinací vhodné koncentrace vzorku, tloušťky kyvety a vhodným rozpouštědlem Typické koncentrace 0,05 – 1 mol l-1 typické objemy 50 – 100 ml typické hmotnosti 1 – 15 mg látky Typický velký počet akumulací počet interferogramů 104, doba - hodiny

Experimentální podmínky ve spektroskopii VCD Rozpouštědla pro měření VCD ve střední IR oblasti a příslušná „spektrální okna“ Rozpouštědlo Spektrální okno / cm-1 CCl4 2000 – 850 DMSO-d6 2000 – 1100; 970 – 700 CS2 2000 – 1640; 1350 – 700 Methanol-d6 2000 – 1200 CHCl3 2000 – 1260; 1175 – 700 H2Oa 2000 – 1770; 1525 – 1000 CDCl3 2000 – 975 D2O 2000 – 1300; 1100 – 800a propanol 2000 – 1500 trifluorethanol a jen jestliže je použita kyveta o tloušťce < 6 mm a vyšší koncentrace CH M 2013 přednáška 4

D2O vs. H2O ve střední IR Absorbance A I/I0 2 0,01 1,8 0,015 0,5 0,32 2 0,01 1,8 0,015 0,5 0,32 Here I show the detail in carbonyl region: The light blue is used for H2O, dark blue D2O and red color is used for the spectra of protein hemoglobin it H2O or D2O, , all with 15 mm pathlegth. The absorbance of about 2 in H2O is too high for VCD measurement in this region. In H2O we have to use very short pathleght a therefore very high concentration to see the signal of sample. CH M 2013 přednáška 4

Korekce na nulovou linii ve spektroskopiích CD Příčiny odchylek od nulové linie zkreslující výsledné exper. spektrum: Dvojlom na optických materiálech čoček, filtrů, kyvet a dalších oken Odrazy od povrchů Vlastní absorpce vzorku v oblasti absorpčního pásu dochází k anomální disperzi velká absorpce způsobuje malou responzi detektoru, zvětšuje šum, zmenšuje S/N Tyto jevy - spektrálně citlivé a způsobují falešné signály pozorované jako artifakty Stálý požadavek ověřování reality CD signálů Formulace a dodržování měřícího protokolu Celé série měření provádět za stejných podmínek (rozbitá kyveta – zkreslení výsledků) CH M 2013 přednáška 4

Ukázka reálné nulové linie (-)-isoschizogamine v CDCl3 Odečtení, spektrum šumu Ukázka reálné nulové linie (-)-isoschizogamine v CDCl3 Surová spektra VCD látky a rozp. Typické rysy: Offset (posun) od nuly Spektrální závislost – pozor na falešné pásy Po odečtu – pásy odpovídají absorpci Ondřej Julínek, 2006 přednáška 2/

Ukázka reálné nulové linie (-)-isoschizogamine v CDCl3 Ondřej Julínek, 2008 Ukázka reálné nulové linie (-)-isoschizogamine v CDCl3 Typické rysy: Offset (posun) od nuly Spektrální závislost – pozor na falešné pásy Po odečtu – pásy odpovídají absorpci přednáška 2/

Korekce na nulovou linii ve spektroskopiích CD Kvalitní spektrum, jsou-li dostupné enantiomery R a S při stejné koncentraci, pro jejich ideální spektra platí experim. CD obou enantiomerů obsahují stejnou spektrální distorzi : úpravou dostaneme z experimentálních spekter „spektrum šumu“, noise, (distorze + šum) a korigované spektrum jednoho enantiomeru: Optimální základní linie – spektrum racemátu o stejné absorpci jako vzorek Nejsou-li dostupné oba enantioméry ani racemát, použijeme ke korekci spektrum rozpouštědla CH M 2013 přednáška 4

4.5 Fluorescenčně detekovaný cirkulární dichroismus (FDCD) Franckův-Condonův princip – popisuje intenzitu ve vibronických přechodech (≡ simultánní přechod mezi elektronovými a vibračními hladinami při absorpci nebo emisi fotonu) k elektronickým přechodům dochází nejpravděpodobněji při zachování mezijaderných vzdáleností (elektronové přechody jsou daleko rychlejší než vibrační) – vertikální přechody kvantově mechanické vysvětlení – překryv vlnových funkcí emise je spontánní, nikoli stimulovaná, proto z nejnižší vibrační hladiny Stokesův posun http://de.wikipedia.org/wiki/Franck-Condon-Prinzip

4.5 Fluorescenčně detekovaný cirkulární dichroismus (FDCD) Excitační spektrum – měří se emise u jedné vlnové délky, zatímco se mění vlnová délka dopadajícího záření, které slouží k excitaci Excitační spektrum – je určeno účinností excitace Emisní spektrum – měří se emise při excitaci určitou fixní délkou, sleduje se emise pro jako funkce vlnové délky. Děje v Jablonského diagramu: zářivé, nezářivé různě rychlé Emisi lze měřit jako excitační nebo fluorescenční (fosforescenční) emisní spektrum:

4.5 Fluorescenčně detekovaný cirkulární dichroismus (FDCD) Intenzita luminiscence závisí na na počtu molekul excitovaných do elektronových stavů toto závisí na intenzitě dopadajícího záření, koncentraci luminiskujících molekul, a účinnosti absorpce na části excitovaných molekul, které emitují záření na účinnosti, s níž je emise zaznamenána detektorem Korekce – na spektrální citlivost fotonásobiče – na reabsorpci CH M 2013 přednáška 4

4.5 Fluorescenčně detekovaný cirkulární dichroismus (FDCD) Ve fluorescenčně detekovaném CD (FDCD) měříme rozdíl v intenzitě fluorescence pro vlevo a vpravo polarizovanou excitaci – vlastně rozdílové excitační spektrum CD: FDCD: Experimentální uspořádání: PMT umístěno pod 90° vzhledem k budícímu paprsku vhodný filtr propouštějící světlo nad určitou vlnovou délku – zabraňuje aby rozptýlené světlo dopadlo na PMT detekující fluorescenci (elastický rozptyl), emise se detekuje jako celková, omezená pouze filtrem, není zde emisní monochromátor 4.5 Fluorescenčně detekovaný cirkulární dichroismus (FDCD) monochromátor polarizátor PEM vzorek PMT PMT „long pass“ filtr monochromátor polarizátor PEM vzorek PMT CH M 2013 přednáška 4

selektivní technika – ke studiu lokální chirality Výhody: selektivní technika – ke studiu lokální chirality detekovány pouze chirální fluorofor (≡ fluoreskující chromofor) v multichromoforní molekule, překrývající se absorpce, která nevede k luminiscenci nepřispívá k detekovanému signálu FDCD experiment náročný, je-li proveden dobře – publikovatelné výsledky CH M 2013 přednáška 4

Praktické poznámky PMT „long pass“ filtr monochromátor polarizátor PEM v hlavní optické není detektor, otvor detektoru je zakryt krytkou (černou stranou dovnitř přístroje), kolmo na optickou osu zapojen velký hlavní fotonásobič (nalepeným popiskem vzhůru) tímto způsobem je možné měřit dvoukanálově FDCD následující spektra FDCD excitační, měnící se excitační vlnová délka, kdy je na velký fotonásobič zachycen celkový světelný tok fluorescence přes všechny vlnové délky, které lze omezit jen pomocí filtrů vkládaných do optické dráhy do speciálního slotu toto měří lock-in zesilovač DC spektra (v tomto nastavení přístroje odpovídají nepolarizovaným FL spektrům otočeným vzhůru nohama (čím vyšší fluorescenční světelný tok, tím nižší voltage) pro měření je nutný dostatečný světelný fluorescenční tok, podobně jako u měření ECD je nutné dosáhnout napětí na fotonásobiči nižší než ~ 900 V PMT „long pass“ filtr monochromátor polarizátor PEM vzorek CH M 2013 přednáška 4

Př. Spektra FDCD roztoku (S) a (R)-(-)1,1-Bi-Naphtholu v MeOH, autor Ettore Castiglioni CH M 2013 přednáška 4

Př. ….. CH M 2013 přednáška 4

Další měřicí mody přístroje pro měření ECD umožňuje simultánní měření CD a fluorescenčních charakteristik vhodné před měřením FDCD a) ECD/fluorescence v hlavní optické ose zapojen velký hlavní fotonásobič kolmo na optickou osu zapojen malý fotonásobič, který měří celkový světelný tok případně omezen filtrem měří se tří kanálově CD spektrum (hlavním fotonásobičem PMT přes lock-in) voltage ~ absorpčnímu spektru (předzesilovač před lock-inem) fluorescenční spektrum excitační (proměnné délka excitace, celkový fluorescenční tok omezený filtrem), měří se sekundárním PMT PMT-sekundární „long pass“ filtr monochromátor polarizátor PEM vzorek PMT-hlavní CH M 2013 přednáška 4

Další měřicí mody přístroje pro měření ECD b) ECD/spektrum fluorescence v hlavní optické ose zapojen velký hlavní fotonásobič kolmo na optickou osu zapojen malý monochromátor na něm seshora malý fotonásobič měří se tří kanálově CD spektrum (hlavním fotonásobičem PMT) voltage ~ absorpčnímu spektru fluorescenční spektrum excitační (proměnné délka excitace, nastavitelná vlnová délka emise) nebo jednokanálově buď excitační fluorescenční spektrum (fixní vlnová délka emise na sekundárním monochromátoru a proměnná vlnová délka excitace na hlavním monochromátoru) nebo emisní fluorescenční spektrum (fixní vlnová délka excitace na hlavním monochromátoru a proměnná vlnová délka emise na sekundárním monochromátoru) PMT-sekundární monochromátor-sekundární monochromátor polarizátor PEM vzorek PMT-hlavní CH M 2013 přednáška 4

4.6 Magnetická optická aktivita (MOA) přírodní (natural) optická aktivita - vlastnost chirálních molekul magnetická optická aktivita – vlastnost všech molekul 2 hlavní formy: magnetická optická rotace magnet. cirkulární dichroismus (MCD) b) Magnetický cirkulární dichroismus (MCD) magnetické pole vyvolává rozštěpení hladin (sejmutí degenerace spojené s magnetickým kvantovým číslem) „coupling“ důsledkem je odlišná interakce s RCP a LCP záření pro chirální vzorek: přírodní optická aktivita     CH M 2013 přednáška 4

4.6 Magnetická optická aktivita (MOA) Popis techniky magnetické pole podél směru šíření záření, které prochází vzorkem (paralelní nebo antiparalelní) změna orientace mag. pole – změna znaménka MCD slouží k identifikaci a ověření, že pozorujeme MCD Užití elektronová struktura základního a excitovaných stavů zvětšení rozlišení v absorpčních spektrech (překrývající pásy mohou mit opačné znaménko) studium metaloporfyrinů (Petr Štěpánek, PhD student u doc. Bouře) studium proteinu obsahující hem monochromátor polarizátor PEM vzorek PMT-hlavní   CH M 2013 přednáška 4

4.6 Magnetická optická aktivita (MOA) a) Magnetické optická rotace (MOR) tzv. Faradayův jev – stáčení rovina lineárně polarizované záření v závislosti na spektru a na mag. poli, prostředí není chirální http://en.wikipedia.org/wiki/Faraday_effect CH M 2013 přednáška 4

4.7 Cirkulárně polarizovaná luminiscence (CPL) excitace nepolarizovaným záření, emise je analyzována na obsah složky RCP a LCP Měřen: rozdíl fluorescenčního signálu LCP a RCP (excitace nepolarizovaná) Užití: elektronová struktura excitovaných stavů CPL a FDCD někdy spojovány dohromady jako fluorescenční optická aktivita (FOA) CH M 2013 přednáška 4

4.8 Ramanova optická aktivita (ROA) Náleží k vibrační optické aktivitě (VOA), protože se testují vibrační hladiny, používá však záření vid., blízké IR (použité obr. z jakéhokoli přehledného článku L. Nafie, např. Annu. Rev. Phys. Chem. 1997. 48:357–86) Srovnejme s VCD, měří se rozdíl v absorpci při přechodu mezi vibračními hladinami v základním elektronovém stavu pro jeden přechod: Ramanova spektroskopie založena na Ramanovu rozptylu (můžeme chápat jako interakci s fononem, molekula získává energii rovnu rozdílu vibračních hladin, zatímco rozptýlené záření je červeně posunuto): měří se rozptýlená intenzita jako spektrální funkce tzv. Stokesova posunu Existují 4 formy ROA – na obr. zjednodušeně zobrazena ROA spojená s přechodem jen mezi dvěma vibračními hladinami CH M 2013 přednáška 4

4.8 Ramanova optická aktivita (ROA) pro srovnání VCD: 4.8 Ramanova optická aktivita (ROA) ROA - dopadající cirkulární polarizace, incident CP (ICP ROA) Dopadající záření je cirkulárně polarizováno Ramanova intenzita měřena buď pro fixní lin. pol. nebo nepolarizované záření Def. R-L (!!!) ROA - rozptýlená cirkulární polarizace, scattered CP (SCP ROA) Dopadající záření má fixní lin. pol. , nebo je nepolarizované, Je měřen rozdíl RCP a LCP rozptýleného záření Def. R-L (!!!) ROA - duální polarizace ve fázi, in-phase dual CP (DCPI ROA) Polarizační stav obou – dopadajícího a rozptýleného záření – je synchronně přepínáno mezi RCP a LCP Def. R-L (!!!) ROA - duální polarizace mimo fázi, out-of-phase dual CP (DCPII ROA) Polarizační stav obou – dopadajícího a rozptýleného záření – je přepínáno mezi RCP a LCP, vždy opačně Def. R-L (!!!)

4.8 Ramanova optická aktivita (ROA) Optické schéma spektrometru (Werner Hug)

Aplikace chiroptických metod Výpočet optické aktivity CH M 2013 přednáška 4