 Biochemický ústav LF MU 2012 (E.T.) Pentosofosfátová dráha. Metabolismus fruktosy a galaktosy. Vznik glukuronové kyseliny a aminocukrů.  Biochemický ústav LF MU 2012 (E.T.)

Pentosofosfátová dráha Tkáňová lokalizace: ve velkém rozsahu játra, tuková tkáň (až 50% metab. glukosy), erytrocyty, štítná žláza, laktující mléčná žláza ad. (obecně tkáně, kde probíhají redukční syntézy) Ostatní tkáně využívají jen některé reakce Buněčná lokalizace: cytoplasma

Význam pentosofosfátové dráhy zdroj NADPH (redukční syntézy, oxygenasy se smíšenou funkcí, redukce glutathionu) zdroj ribosa-5-P (nukleové kyseliny, nukleotidy) zapojení pentos přijatých potravou do metabolismu Neslouží k zisku energie, ani energii přímo nespotřebovává

Dvě části pentosofosfátové dráhy oxidační část nevratné reakce neoxidační část (regenerační) vratné reakce

Oxidační část pentosofosfátové dráhy NADP+ NADPH + H+ Glukosa-6-P 6-fosfoglukonolakton laktonasa glukosa-6-P-dehydrogenasa 6-fosfoglukonát NADP+ NADPH + H+ 6-fosfoglukonátdehydrogenasa Ribulosa-5-P + CO2 Regulace: inhibice NADPH (inhibice produktem)

6-fosfoglukono--lakton Glukosa-6-P 6-fosfoglukonát Oxidační část pentosofosfátové dráhy (podrobněji) – vznik 6-fosfoglukonátu C O - H P NADPH + H+ NADP+ H2O C H O P 2 C H O P 2 O O O H O H laktonasa glukosa-6-P-dehydrogenasa H O O H O H O H O H O H 6-fosfoglukono--lakton Glukosa-6-P 6-fosfoglukonát

6-fosfoglukonát ribulosa-5-P Oxidační část pentosofosfátové dráhy (podrobněji) –přeměna 6-fosfoglukonátu NADP+ NADPH + H+ C O - H P H C O P 6-phosphoglukonátdehydrogenasa CO2 6-fosfoglukonát ribulosa-5-P Ziskem oxidační větve pentosového cyklu jsou 2 moly NADPH a pentosa fosfát

Regenerační fáze pentosofosfátové dráhy (pokud pentosy nejsou využity pro syntézu nukleotidů) souhrnná rovnice: 3 Ribulosa-5-P 2 Fruktosa-6-P + Glyceraldehyd-3-P Proč regenerace ? Některé buňky potřebují mnoho NADPH. Při jeho produkci vzniká velké množství pentos, které buňka nepotřebuje.

Enzymy v regenerační fázi pentosofosfátové dráhy Isomerasa H C O P Syntéza nukleotidů Ribosa-5-P Ribulosa-5-P Pentosový cyklus – regenerační fáze

Epimerasa H C O P Ribulosa-5-P Xylulosa-5-P

Transketolasa - přenáší dvouuhlíkatý zbytek C O H H C O P C O HO C H + H C O H + H C O H H C O H H C O P Glyceraldehyd-3-P H Sedoheptulosa-7-P Ribosa-5-P Xylulosa -5-P 5C 5C 3C 7C + + Kofaktor: thiamindifosfát

Transaldolasa - přenáší tříuhlíkatý zbytek C H O P C H O P H + + Glyceraldehyd-3-P Erythrosa-4-P Sedoheptulosa-7-P Fruktosa-6-P + 4C + 6C 7C 3C

Transketolasa-přenáší dvouuhlíkatý zbytek C O H C O + + H O C H H C O H H C O H Erythrosa-4-P H C O P Xylulosa -5-P H Fruktosa-6-P Glyceraldehyd-3-P 3C 5C 6C + 4C +

Souhrnná bilance pentosafosfátové dráhy Ribulosa-5-P Ribosa -5-P 2 Ribulosa-5-P 2 Xylulosa -5-P Xylu-5-P + Rib-5-P Glyc-3-P + Sed-7-P Sed-7-P + Glyc-3-P Ery-4-P + Fru-6-P Xylu-5-P + Ery-4-P Glyc-3-P + Fru-6-P 3 Ribulosa-5-P Glyceraldehyd-3-P + 2 Fru-6-P 3C + 2 x 6C 3 x 5C

Ribulosa-5-P C H O P H Erytrosa-4-P Xylulosa-5-P Ribosa-5-P C H O P H TK TA TK C H O P H H C O H C O Ribulosa-5-P H O C H H C O H H C O P Xylulosa-5-P H Glyceraldehyd-3-P

Tvorba ribosafosfátu z meziproduktů glykolýzy Reakce regenerační fáze pentosového cyklu jsou vratné. To umožňuje produkovat pentosy v buňce i v situacích, kdy není potřebné NADPH, pouhým zvratem reakcí regenerační fáze, z meziproduktů glykolýzy.

Transketolasová reakce v opačném směru fruktosa-6-P + glyceraldehyd-3-P erytrosa-4-P + xylulosa-5-P (z glykolýzy) Transaldolasová reakce v opačném směru erytrosa-4-P + fruktosa-6-P sedoheptulosa-7-P + glyceraldehyd-3-P (z glykolýzy) Další transketolasová reakce v opačném směru sedoheptulosa-7-P + glyceraldehyd-3-P 2 pentosy

Regulace pentosofosfátové dráhy rychlost závisí na úvodních nevratných reakcích oxidační fáze (viz též snímek 5) dostupnost substrátu (NADP+), inhibice produktem indukce enzymů insulinem

Potřeby buňky určují směr reakcí pentosofosfátové dráhy Potřeba buňky Směr dráhy pouze NADPH Oxidativní větev produkuje NADPH, regenerační fáze konvertuje pentosy na Glc-6-P NADPH + ribosa-5-P Oxidativní větev produkuje NADPH a ribuloso-5-P, isomerasa ji přeměňuje na ribosu pouze ribosa-5-P Probíhá konverze fruktosa-6-P a glyceraldehydu-5-P na ribosa-5-P NADPH a pyruvát Oxidativní větev produkuje NADPH, regenerační fáze přeměňuje ribulosa-5-P na fruktosa-6-P a glyceraldehyd-3-P, glykolýza produkuje pyruvát

Reakce vyžadující NADPH redukce oxidovaného glutathionu monooxygenázové reakce s cytP450 respirační vzplanutí v leukocytech redukční syntézy: syntéza mastných kyselin elongace mastných kyselin syntéza cholesterolu a steroidů syntéza nukleotidů syntéza NO z argininu

NADH x NADPH / srovnání NADH NADPH Charakteristika NADH NADPH vznik převážně při dehydrogenaci substrátů v katabolických dějích při dehydrogenaci substrátů v reakcích jiných než katabolických využití převážně dýchací řetezec* redukční syntézy a detoxikační reakce V dých. řetězci nemůže být oxidován Forma převažující v buňce NAD+ * Transhydrogenasa v mitochondriální membráně může katalyzovat přenos H z NADH na NADP+

Význam pentosofosfátové dráhy pro erytrocyty Pentosový cyklus je jediným zdrojem NADPH pro erc 5-10% glukosy v erc NADPH je potřebný na regeneraci glutathionu Oxidovaný glutathion vzniká při odbourávání peroxidu vodíku a organických peroxidů v erytrocytu. Hromadění peroxidů v buňce vyvolává hemolýzu 2GSH + HO-OH → GS-SG + 2H2O GS-SG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ glutathionreduktasa Hromadění peroxidů v buňce vyvolává hemolýzu

Deficit glukosa-6-P dehydrogenasy v erytrocytech vrozená choroba způsobena bodovými mutacemi genu v chromosomu X u některých populací (až 400 různých mutací) až 400 milionů jedinců erytrocyty mají nedostatek redukovaného glutathionu choroba je často bezpříznaková a projeví se episodami hemolytické anemie po infekci, při užití některých léků (AAA)* nebo favových bobů (Vicia fava) Vysoká frekvence v tropických oblastech Afriky, Středomoří AAA* - antimalarika, antibiotika, antipyretika

Heinzova tělíska v erytrocytech s deficitem glukosa-6-P-dehydrogenasy Při deficitu redukovaného glutathionu dochází k poškození proteinů – částečná denaturace Vznikají nerozpustné proteiny vázané k membráně – Heinzova tělíska Erytrocyty jsou rigidní a nedeformovatelné – jsou odstraňovány makrofágy v játrech a slezině.

Favismus Hemolýza po požití bobů druhu Vicia fava

Metabolismus fruktosy Zdroj fruktosy: sacharosa z potravy, ovoce, med, HFCS Dříve příjem fruktosy 16-20 g/d, nyní se odhaduje až 85-100 g/d * HFCS (High fructose corn syrup). Vstup do buněk: GLUT V

Fruktosa a glukosa - srovnání Resorpce ve střevě Metabolismus Poločas v krvi Místo metabolismu KM pro hexokinasu KM pro fruktokinasu Vliv insulinu rychlejší, SGLT pomalejší 43 min většina tkání 0,1 mmol/l -  pomalejší, GLUT-5 rychlejší 18 min hlavně játra, ledviny, ercs 3 mmol/l 0,5 mmol/l

Zásadní rozdíly mezi metabolismem glukosy a fruktosy Fruktosa je metabolizována hlavně v játrech, enzymem fruktokinasou Hexokinasa působí jen při vysoké koncentraci fruktosy Játra metabolizují rychleji fruktosu než glukosu Fruktosa sama nevyvolává uvolnění insulinu Avšak příjem fruktosy může vyvolat následné zvýšení hladiny insulinu v důsledku přeměny fruktosy na glukosu

Metabolismus fruktosy Převážná část fruktosy je metabolizována v játrech 2 1 Fruktosa ATP není regulovaná velmi nízké KM hexokinasa fruktokinasa Srovnejte s metabolismem glukosy Fruktosa- 1-P Fruktoso-6-P aldolasa B Zpětná konverze na glukosu Glyceraldehyd + dihydroxyaceton-P aldolasa B ATP triosa-kinasa Glyceraldehyd-3-P glykolýza

Aldolasa A a aldolasa B jsou isoenzymy (je známa i aldolasa C) aldolasa A : glykolýza (štěpení Fru-1,6-bisP) aldolasa B: štěpení fruktosa-1-P glukoneogenese (syntéza Fru-1,6-bisP)

Na rozdíl od glukosy je fruktosa rychle odbourána Proč ?

Fruktokinasa a aldolasa B (játra): 1 metabolismus obchází regulované enzymy glykolýzy (hexokinasu a fosfofruktokinasu)  rychlé odbourání  fruktosa je rychlý, na insulinu nezávislý zdroj energie vysoký příjem fruktosy a její rychlý metabolismus na acetylCoA vede ke zvýšené tvorbě mastných kyselin a následně ke zvýšení produkce triacylglycerolů vysoký příjem fruktosy může spotřebovat značné množství fosfátu na syntézu fruktosa-1-fosfátu. Fosfát chybí pro syntézu ATP.

Dříve se fruktosa doporučovala diabetikům jako neškodné sladidlo Současná doporučení: malé množství fruktosy v ovoci je neškodné slazení fruktosou nebo jiný vyšší příjem fruktosy (např. formou infuze) – není doporučeno

Poruchy metabolismu fruktosy Chybění aldolasy B – závažné !!! - hereditární fruktosová intolerance (autosomálně recesivní choroba) 1/40 000 Fruktosa-1-P se hromadí v buňkách jater → hypoglykemie Proč hypoglykemie? Hromadící se Fru-1-P inhibuje glykogenolýzu a glukoneogenezi Nutné včasné odhalení, objeví se po té, co kojenec začne přijímat sacharosu (v prvních týdnech života velmi závažné) (v některých zemích neonatální skrínink) Úprava dietou bez fruktosy a sacharosy

Poruchy metabolismu fruktosy Chybění fruktokinasy -benigní - esenciální fruktosurie Fruktosa se hromadí v krvi a vylučuje do moči Bez závažných projevů Dieta bez fruktosy Diagnostika: pozitivní redukční zkouška v moči průkaz glukosy specifickým testem negativní

Polyolová metabolická dráha - alternativní přeměna glukosy na glucitol a fruktosu v některých buňkách při vyšší koncentraci glukosy Glucitol nemůže z buňky unikat, pokud není přeměňován na fruktosu, hromadí se NADPH + H+ NADP+ D-glucitol D-glukosa aldosareduktasa NAD+ Játra, spermie, ovariální b. polyoldehydrogenasa NADH + H+ Chybí v čočce, retině, nervových buňkách Fruktosa (hlavní zdroj energie pro spermie)

Pozdní komplikace diabetu při diabetické hyperglykemii vstupuje glukosa do buněk, které pro její vstup nevyžadují insulin tvoří se D-glucitol, který nemůže z buňky unikat (past) aktivita polyoldehydrogenasy v některých buňkách je malá (retina, čočka, nervová b.) D-glucitol se hromadí Zvýšený osmotický tlak vyvolává poruchy buněk (diabetická katarakta, retinopatie, neuropatie)

Metabolismus galaktosy zdroj: laktosa (mléko*) přeměna v játrech na glukosu epimerace aby mohla proběhnout, je třeba galaktosu aktivovat: na UDP-galaktosu * Ostatní mléčné výrobky (kefíry, tvaroh, sýry) laktosu téměř neobsahují

UDP-galaktosa (aktivní forma galaktosy) OH OH OH nevzniká přímou reakcí s UTP, nýbrž reakcí s UDP-glukosou

Metabolismus galaktosy v játrech Galaktosa je rychle metabolizována na glukosu Galaktosa ATP Galaktokinasa ADP UDP-glukosa Gal-1-P uridyltransferasa Glukosa-1-P UDP-galaktosa syntéza glykolipidů, GAG.. glykogen epimerasa UDP-glukosa

Izomerace glukosy na galaktosu UDP-galaktosa epimerasa reakce je vratná, může být využita i k produkci glukosy UDP-glukosa Význam galaktosy syntéza laktosy syntéza glykolipidů, proteoglykanů a glykoproteinů

Porucha metabolismu: „klasická“ galaktosemie nedostatek uridyltransferasy - závažné !!!! akumulace galaktosa-1-P a galaktosy 1:40 000-60 000 živě narozených dětí, dědičnost onemocnění je autosomálně recesivní interference s metabolismem fosfátů a glukosy, akumulace galaktosy a galaktosa-1-P v ledvinách, játrech, mozku a oční čočce konverse galaktosy na galaktitol v oku – katarakta nebezpečné pro novorozence, příznaky mezi 4.-9. dnem, hepatomegalie, ikterus, letargie, křeče neléčená galaktosemie vede k poškození jater, ledvin, mozku restrikce mléka a mléčných výrobků

Biosyntéza laktosy specifická pro mléčnou žlázu UDP-galaktosa Laktosa (galaktosyl-1,4-glukosa) glukosa Laktosasynthasa Laktosasynthasa je komplex dvou proteinů: galaktosyltransferasa (přítomná v mnoha tkáních) -laktalbumin (přítomný v mléčné žláze jen při laktaci, syntéza je stimulována prolaktinem)

Metabolismus galaktosy v jiných buňkách Galaktosa a N-acetylgalaktosamin Jsou důležité komponenty glykoproteinů, proteoglykanů a glykolipidů. Syntéza těchto sacharidů probíhá ve všech typech buněk, galaktosyl and N-acetylgalaktosyl jsou přenášeny z UDP-galaktosy and UDP-N-acetyl-galaktosy pomocí UDP-galactosyltransferasy.

Metabolická dráha glukuronátu 2 P U D T glukosa-6-P glukosa-1-P UDP-glukosa N A + glukosiduronáty UDP-glukuronát volný glukuronát glykosaminoglykany UDP-galakturonát UDP-iduronát

Příklady sloučenin vylučovaných ve formě glukosiduronátů Estrogeny Bilirubin Progesteron Meprobamat Morphin ad.

Odbourání D-glukuronové kyseliny Primáti a morčata NADPH + H+ NADP+ C O O H H O L-gulonát L-askorbát O H O H O H O H CO2 Kyselina D-glukuronová L-xylulosa blok: →esenciální pentosurie, pentosy v moči xylitol D-xylulosa může vstoupit do pentosového cyklu Xylulosa-5-P

Syntéza L-askorbátu - + H2O 1,4-lakton L-gulonové kyseliny C H O H 2 - C H O H 1,4-lakton L-gulonové kyseliny C O O O H O C H O + H2O 1 H O C H H H H C O H H O C H O H O H H C H L-gulonolaktonoxidáza -2H O H O H C 2 L-gulonát kys.askorbová

L-gulonolaktonoxidáza je neaktivní u primátů, a tedy i u člověka, ale též u ryb a ptáků. Aktivní u většiny obratlovců Je to výsledek ztrátové mutace (vlivem volných radikálů či virové infekce?) u předchůdce podřádu Anthropoidea asi před 25 milióny lety A co morče? Genom morčete obsahuje jiné pozůstatky genu pro gulonolaktonoxidázu. Fungovat tento gen přestal přibližně před 20 miliony let – morče tedy přišlo k své závislosti na vitaminu C jindy a jinak než my. Kyselinu askorbovou potřebují i rostliny.

Historie vitaminu C 1754 – James Lind vydal knihu A Treatise on Scurvy, v níž navrhl citrony jako prevenci proti kurdějím. 1761 – Východoindická společnost doporučila používat na svých lodích citrony a pomeranče. 1795 – Bylo zavedeno preventivní podávání citronové šťávy na lodích anglického válečného námořnictva 1911 – Kazimir Funk přišel s hypotézou, že příčinou některých závažných chorob může být nedostatek určitých nezbytných stopových látek – vitaminů –ve výživě. Prvními nemocemi, jejichž příčina byla hledána v avitaminóze, byly xeroftalmie (šeroslepost), beri-beri a kurděje; hypotetické vitaminy byly označeny A, B a C. 1928 – Albert von Szent-Györgyi izoloval kyselinu askorbovou z papriky (Nobelovu cenu za to dostal r. 1937.) 1933 – Tadeus Reichstein vyřešil chemickou syntézu kyseliny L-askorbové 1957 – J. J. Burns objasnil biochemickou příčinu, proč člověk, opice a morče (na rozdíl od řady jiných obratlovců) nejsou schopni syntetizovat vitamin C. Dle VESMÍR 80, září 2001 497

Kyselina askorbová je významný antioxidant Nejvyšší koncentrace polymorfonukleáry, nadledviny, také v oční čočce. Kyselina askorbová je důležitou složkou mnoha oxidačně-redukčních reakcí Redox potenciál +0,08 V, může redukovat O2, cytochromy a,c ad. V některých funkcích ji mohou nahradit jiné antioxidanty, v jiných je patrně nezastupitelná. Je nezbytným kofaktorem při syntéze kolagenu (hydroxylace prolinu)

Příčiny skorbutu Hydroxylace prolinu je nezbytná pro stabilitu kolagenu Bez této posttranslační modifikace jsou molekuly kolagenu nestabilní a nejsou schopny vytvářet správné vyšší struktury. Nedostatek vitaminu C se tak projeví na kvalitě všech tkání – postiženy jsou bazální membrány, stěny cév, vazy, kosti aj.

Přehled hlavních drah v metabolismu sacharidů GLUKOSA Glc-6-P Fru-6-P Fru-1,6-bisP Gra-3-P GALAKTOSA Gal-1-P Glc-1-P GLYKOGEN UDP-Glc UDP-Gal UDP-GlcUA GlcUA CO2 Xyl-5-P FRUKTOSA Glucitol Fru-1-P Glyceraldehyd PYRUVÁT Oxaloacetát Laktát ACETYL-CoA

Hexosaminová biosyntetická dráha (hexosamine biosynthetic pathway - HBP) Glc-6-P 1-3% Glc-1-P Glc-N-6-P Fru-6-P UDP-GlcNAc glykogen glykolýza Glykosylační pochody Tvorba glykoproteinů a glykolipidů

Význam glykoproteinů Interakce mezi buňkami, interakce s hormony, virusy Antigenicita (krevní skupiny atd.) Komponenty extracelulární matrix Tvorba mucinů (protektivní účinek v trávicím traktu, močových a dýchacích cestách)

Sacharidy přítomné v glykoproteinech a glykolipidech Zkratka: Hexosy: Glukosa Glc Galaktosa Gal Mannosa Man Acetyl. hexosaminy: N-Acetylglukosamin GlcNAc N-Acetylgalaktosamin GalNAc Pentosy: Xylosa Xyl Arabinosa Ara Deoxyhexosy (Methyl pentosa): L-Fukosa Fuc Sialové kys. : N-Acetylneuraminová k. NeuNAc

Glykoproteiny krevní plazmy Příklady sacharidových komponent glykolipidů a glykoproteinů: NeuNAc Glykoproteiny krevní plazmy Ceramid (sphingolipid) nebo protein Glykoproteiny krevních skupin

Syntéza aminocukrů vychází z fruktosa-6-P 2 H N C H 2 C H Aminotransferasa 2 C H C H O H + C H O H 2 2 2 C H 2 C H C O C N 2 H C C H O C H H N O H O C H 2 H O O H C O H L-glutamin H C O H L-glutamát H C O H H C O H C H O P C H O P 2 2 D-fruktosa-6-P 2-imino-D-fruktosa-6-P

Iminofruktosa-6-P izomeruje na glukosamin-6-P 2-imino-D-fruktosa C H 2 O N P p řesmyk D-glukosamin-6-P -6-P

Acetylace -NH2 skupiny odstraní její bazicitu 3 H O C H Acetyl-CoA H O C H H C O H H C O H H C O H H C O H C H O P C H O P 2 2 D-glukosamin-6-P N-Acetyl-D-glukosamin-6-P

Sialové kyseliny Acylderiváty kyseliny neuraminové Nejběžnější N-acetylneuraminová kyselina CH3CO C H 2 C=O COOH HC–OH HO–CH CH2–OH -NH–CH

Syntéza N-acetylneuraminové kyseliny H O CH3CO NH C H H O C H C H O 2 P NH H C O H H C O H C H O P 2 N-acetylmannosamin-6-P fosfoenolpyruvát CH3CO N-acetylneuraminová kyselina

Aktivace aminocukrů pro syntézu glykoproteinů a glykosaminoglykanů - přehled Glucose 6-P Glucose 1-P UDP-Glucose UDP-Galactose UDP-Glucuronic acid UDP-Xylose Fructose 6-P Mannose 6-P Mannose 1-P GDP-Mannose GDP-L-Fucose N-Acetylglucosamine 6-P N-Acetylglucosamine 1-P UDP-N-Acetylglucosamine UDP-N-Acetylmannosamine UDP-N-Acetylgalactosamine N-Acetylneuraminic acid CMP-N-Acetylneuraminic acid CTP UTP GTP