Postranslační děje v buňce Sbalení proteinů pomocí chaperonů Degradace proteinů Kovaletní modifikace proteinů Transport proteinů v buňce

Po translaci Protein musí být sbalen do své fuknční 3D podoby Vazba důležitých kofaktorů Kovalentní modifikace Fosforylace Methylace Acetylace Glycosylace Farnesylace atd. Sbalení do proteinového komplexu Alberts page 387

Po translaci Cytoplasma je neobyčejně koncentrovaný roztok proteinů (300 – 400mg/ml) PROBLEM: jak se čerstvě translatované proteiny maji v pořádku sbalit v tomto vysoce koncetrovaném roztoku, aniž by agregovaly ?

Chaperony Mnoho proteinů se neumí sbalit samovolně Chaperoniny/ Chaperony: Proteiny, které asistují jiným proteinům a pomáhají jim zaujmout správnou konfromaci Role spočívá především v zabránění špatného sbalení, než v aktivním napomáhaní Můžou prodloužit dobu sbalení a tudíž ovlivňovat čas působení proteinu Můžou také ‚zachránit‘ již špatně sbalený protein, rozbalit ho a umožnit mu zaujmout správnou konformaci

Chaperony Heat shock proteiny Exprese heat shock proteinů se zvyšuje spolu s teplotou, jelikož při vyšší teplotě je větší šance, že proteiny budou denaturovat a špatně zaujímat svou konformaci 6 velkých rodin (číslo odpovídá velikosti proteinu) Hsp60, hsp70, hsp 100, hsp 110 Mají afinitu k exponovaným hydrofóbním oblastem proteinu, který není finálně sbalen Hsp 70 Důležitý pro sbalování proteinů ko-translačně Hsp 60/GroEL Pracují s proteiny, které jíž byly plně syntetizovány (po-translačně)

Hsp70 5. Protein spontánně zaujme svou správnou konfromaci 3. Hsp70-ADP se silně váže na peptid a zabraňuje jeho agregaci 1. Hsp70-ATP se váže na hydrofóbní postranní řetězce polypetidového řetězce, který se syntetizuje na ribozómu 4. Nucleotide exchange factors eventuálně vymění ADP za ATP a Hsp70-ATP se uvolňuje z proteinu 2.Vazba peptidu na Hsp70 iniciuje hydrolýzu ATP 6. Malé procento proteinů se sbalí špatně

Hsp60/GroEL GroEL-GroES z E. Coli Gro E operon – 2 proteiny GroEL 58Kd, GroES 10 Kda Aktivní komplex obsahuje 14 podjednotek GroEL a 7 kopií GroES, 10Mda 2 prstence, které nejsou průchodné Sbalování proteinu trvá cca 20s, může být opakováno Jeden cyklus spotřebuje přibližně 7-14ATP

Multi-subunit complex ‘cocktail shaker’ Hsp60/GroEL Dutina se 2x zvětší a je hydrofilní 1. Špatně sbalený protein s exponovanými hydrofóbními oblastmi se váže na hydrofóbní oblast 3. Hydrolýza navázeného ATP (plus další ATP molekuly) uvolní GroEC čepičku a dojde k uvolnění proteinu do cytoplasmy Open konformace 2. Vazba GroES čepičky a konformační změny díky vazby ATP uvolňuje navázany protein do lumen GroEL, kde dojde ke správnému sbalení Closed konformace 4. Další špatně sbalený protein se váže na druhou stranu GroEL proteinu

Monitorování kvality proteinu Rychle se sbalující proteiny se obvykle sbalí bez problémů Pomalu se sbalující proteiny – pomoc Hsp proteinů Pokud proteiny jsou inkompletně sbaleny (po několika pokusech), jsou cíleny k degradaci

Proteasome Obrovský 2MDa velký proteinový komplex, jaderný a cytoplasmatický (26S) 20S centrální část je tvořena heptamerickými kruhy, které vytváří dutinu pro bezpečnou degradaci proteinu 19S regulační část Strukturní/regulační podjednotka  Proteolyticky aktivní podjednotka β 20S centrální část - katalytická 26S proteasome (cryo-electron microscopy)

Proteasome - unfoldase Hexamerický kruh regulační oblasti Unfoldase AAA proteiny Vazba proteinu určený k destrukci, či rozbalení (tag) ATP dependetní změna jedné podjednotky vtahuje sbalený portein dovntiř a tím ho rozbaluje U stabilních proteinu může dojít až ke stovkám ATP/ADP cyklům než je celý protein vtažen do 20S proteasomu

Ubiquitin Malý 76AA protein Volný Záleží na počtu ubiquitinových molekul, jak jsou na sebe navázány (vazba pře Lys48, nebo Lys63) Vázaný na protein a udává další osud proteinu: Degradace Regulace Endocytóza DNA oprava

Ubiquitination of condemned proteins requires three enzymes: Ubiquitinace – značka pro degradace 2) E2 ubiquitin konjugační enzym rozeznává E1 komplex a přenáší ho na sebe Ubiquitination of condemned proteins requires three enzymes: 1) E1 ubiquitin aktivační enzym hydrolyzuje ATP a váže na sebe jednu molekulul ubiquitinu (tím ho aktivuje)

Ubiquitinace – značka pro degradace 3) E3 ubiquitin ligáza se váže na substrátový protein a dojde k přenosu ubiquitinu na protein, který má být degradován. Tyto 3 kroky se opakují několikrát

Degradace - summary Vlastní ubiquitin projde proteasomem nenaštípán, specifická peptidáza ho odštípne a tím ho recykluje Krátké peptidy jsou z cytosolu dopraveny do ER, GA a lysozomu Exotermně rozštípány pomocí peptidáz

Kovalentni modifikace proteinů 50-90% proteinů v buňce je postranslačně modifikováno Fosforylace na Ser, Thr, Tyr Methylace na Lys, Arg N-Acetylace na Lys Lipidace Ubiquitinace na Lys N-acetylglucosaminace na Ser a Thr

Fosforylace Nejdůležitější potranslační modifikace Důležitá pro signální dráhy, metabolismus, intracelulární membránový přenos, genovou transkripci, pohyb atd. PO2- - negativní náboj, ovlivňuje konformaci proteinu Vytváří vodíkové můstky s amidovými skupinami AK Vytváří iontové vazby s kladně nabitými AK Reverzibilní 2 enzymy Fosfatáza – odebírá P Kináza – přidává P

Metabolismus glykogenu je regulován pomocí fosforylace Signál pro ukončení uchovávání glukózy v podobě glykogenu a spouštějící uvolnění glukózy je procesován kinase A. Fosforylace glykogen syntázy ukončuje syntézu glykogenu Fosforylace glykogen fosforylázy vede k aktivaci tohoto enzymu a rozložení glykogenu na glukózu-1- fosfát a začátek glykolýzy. Figure 3-73 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Ukotvení membránových proteinů do membrány Myristylace – 14-ti uhlíková mastná kyselina G proteiny (Ras family) G protein coupled receptors Palmitylace – 16-ti uhlíková MK Farnesylace – připojení isoprenoidu Thio-esterová vazba LABILNI Thio-eterová vazba Amidová vazba STABILNI Mastná kyselina Isoprenoidy

GPI-modifikace proteinů v ER Kovalentní modifikace proteinů v ER Přidání glykosylfosfatidyl inositolové kotvy Ukotvení proteinu v membráně pomocí uhlovodíkového řetězce Proteiny jsou cíleny do plasmatické membrány U T. brucei – VSG proteiny jsou připojeny pomocí GPI modifikace – shedding of antibodies

GPI-modifikace proteinů v ER Kovalentní modifikace proteinů v ER Přidání glykosylfosfatidyl inositolové kotvy Ukotvení proteinu v membráně pomocí uhlovodíkového řetězce Proteiny jsou cíleny do plasmatické membrány U T. brucei – VSG proteiny jsou připojeny pomocí GPI modifikace – shedding of antibodies C-term hydrofóbní oblast (15 – 20 AK) Vazba může být přerušena phospholipázou – signální molekula

Methylace Arg nebo Lys Modifikace jaderných proteinů Methyltransferase (substrát je S-adenosylmethionine) Nevratná (vazba je velmi stabilní, demethylázy nebyly nalezeny) Methylace nemění náboj, ale mění sterickou konformaci, přerušuje vodíkové můstky Mění protein-protein interakce Methylace jaderných ribonukleových proteinů (hnRNPs) Role v transportu RNA a pre-mRNA processing Methylace histonů Lys methylace Důležité pro regulaci genové exprese, DNA repair, DNA replikaci

Acetylace Lysine N-acetyltransferase, acetyl skupina je odebrata z acetyl-CoA Až 1/3 proteinů modifikována Acetylace N-konce proteinu je nevratná, acetylace lysinu je reverzibilní (deacetylázy) Mění náboj! Acetylace histonů – hlavní role v regulaci genvé exprese Acetylovaný histon – aktivní chromatin

Sumylace SUMO – small ubiquitine related modifier Vazba na sekvenci LysXGlu pomocí specifických SUMO aktivačních a konjugačních enzymů Sumylace proteinů důležitá např. pro buněčný cyklus Sumylace proteinů může změnit jejich lokalizaci, transkripční aktivitu a stabilitu

Postranslační modifikace Příklad: P53 – tumor supresor, důležitý pro regulaci buněčného cyklu, prevence vzniku rakoviny v nepoškozených buňkách je p53 rychle degradován díky vazebnému partneru Mdm2 – ubiquitine ligáza v poškozené buňce dojde k fosforylace, snižení vazby na Mdm2, stabilizace p53, aktivace transkripce Figure 3-81a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Post translační modifikace zvyšují možné variace produktu jednoho genu Postranslační modifikace Post translační modifikace zvyšují možné variace produktu jednoho genu Tato variabilita umožňuje komplexnější regulaci funkce proteinů a také přímo ovlivňuje jejich funkci

Transport proteinů v buňce

Transport proteinů v buňce

Signální sekvence Signální sekvence určují správnou adresu proteinu v rámci buňky Signální sekvence Import do jádra Export z jádra Import do mitochondrie Import do plastidu Import do peroxisomu Import do ER Návrat do ER

Transport proteinů do jádra Jaderná membrána Vnější a vnitřní Specifická proteinová kompozice Perinukleární prostor lumen ER Jaderný pór (50 – 10nm) Malé látky + proteiny do 50Kda volně procházejí Větší proteiny – signál nukleární lokalizace

Jaderný pór Nuclear pore complexes NPCs 125MDa 30 podjednotek – nukleoporiny Oktagonální symetrie Každé jádro obsahuje okolo 3000 – 4000 NPCs Každý NPC přenese až 500 molekul/sec Přenos je obousměrný Pasivní přenos – difúze Aktivní (NLS)

Signál nukleární lokalizace Pomocí mutací velmi přesně definován Signál je rozeznáván pomocí jaderných importních receptorů Alespoň 3 kladně nabité AK s prolinem v blízkosti

Obousměrnost pohybu Jaderný import signál vs jaderný export signál Importní receptory vs exportní receptory RAN GTPase Cytosolický Ran-GTPase Activating Protein Jaderný Ran-Guanine Exchange Factor Gradient Ran-GDP/Ran-GTP

Obousměrnost pohybu EXPORT IMPORT 1. Protein se NLS se váže na cytosolický importní receptor a pomocí fibril s FG motivy prochází pórem 3. Receptor spolu s Ran-GTP je transportován zpět do cytosolu, kde dojde k defosforylace a uvolnění těchto dvou molekul 2. Ran-GTP se váže a způsobuje uvolnění proteinu

Cytosol - ER Endoplasmatické retikulum Síťový labyrinth tubulů a váčků Až 10% objemu buňky Import do ER je ko-translační

ER import Po syntéze prvních cca 70AK se objeví signální sekvence (cca 25-30AK s centrálními 8 – 10 nepolárních AK) SRP – signální rozeznávací částice Tyčkovitá molekula 6 podjednotek + 7S RNA Doména způsobující přestávku v translaci (p9/p14) Hydrofóbní kapsa - methionin AK, váže SS (p54) p68/p72 – vazba specifický receptor

ER import 1. Vazba SRP na signální sekvenci 2. SRP receptor váže SRP a usměrňuje ho směrem k translokátor 3.SRP částice je odpojena ve chvíli, kdy je ribozóm navázan na translokátor, pokračuje v translaci a protein prochází do vnitř ER

ER import – rozpustné a membránové proteiny 3. degradace signální částice 1. Signální sekvence funguje jako translokační signál 2. Signální peptidáza odštěpuje sekvenci a protein je uvolněn do lumen ER 1. Translokační signál 2. Signál zastavující translokaci Pokud je blíže C-term konci – C‘ konec bude v cytosolu (typ I) Pokud je blíže k N-term konci, N‘ konec bude v cytosolu (typ II) 3. Translokátor mění svou konformaci, dochází k uvolnění proteinu do membrány

Glykosylace proteinů v ER Většina proteinů v lumen ER je určena k exportu Pokud protein má zůstat v ER – retenční signál na C‘ konci (KDEL, 4AK) Glykosylace probíhá v ER (až 50% proteinů v buňce je glykosylováno) N-glykosylace (v 90% procentech) N-linkage Core region Oligosacharid 14 molekul

Glykosylace proteinů v ER Oligosaccharyl transferase (enzymatický komplex) Dolichol (lipid) High energy pyrophosphate bond Single enzymatic step

Glykosylace proteinů v ER Kontrola kvality Figure 12-51 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Vesikulární transport

Galaktosyl transferáza Glykosylace v Golgi N-glykosylace v ER, odstranění glukózy a manózy Modifikace v Golgi – funkční dopad Všechny enzymy v Golgi jsou membránové (oproti ER) Glucosidázy, manosidázy Glycosyl, galactosyl, sialyl l transferázy Mannosidáza II Mannosidáza I GlcN transferáza Galaktosyl transferáza Sialyl transferáza

Glykosylace v Golgi 2 hlavní skupiny oligoscharidů u savců Complex oligosaccharide High-mannose oligosaccharide

O-linked glycosylace V Golgi Cukr ke přidán k –OH skupině serinu, či threoninu Příklad: muciny, komponenty extracelulární matrix, Notch, ochranný kabát http://vcell.ndsu.edu/animations/downloads/subtitled/ProteinModification_eng.mp4

Transport proteinů do mitochondrie Během sekund a minut po translaci Transportovány post-translačně Signální sekvence na N‘ term  matrix Interní signální sekvence  IM, IMS, OM

Mt signální sekvence Obvykle 20 – 25 AK Nepolární nenabité AK, přibližně každá čtvrtá AK je Arg, či Lys Amfipatický alpha helix Jedna strana je pozitivně nabita Druhá je nepolární

Přenos proteinu do mitochondrie TOM complex TIM 23 complex – import matrixových proteinů TIM 22 complex – import IM proteinů SAM complex – import OM proteinů OXA complex – import mt kódovaných proteinů

Mt signální sekvence

Přenos proteinu do matrix mitochondrie Vyžaduje ATP a to na cytosolické a matrixové straně Vyžaduje membránový potenciál Cytosolický ATP napomáhá vazbě SS na TOM, pak se odpojuje SS postupuje směrem k Tim23 SS je translokována do matrix, tento proces vyžaduje MP Protein je vtahován mtHsp70 za hydrolýzy ATP

Přenos proteinu do IM a IMS Přes Tim23 – signální sekvence a stop-transfer sekvence (hydrofóbní) Pomocí Oxa1 komplexu Přes Tim22 http://www.youtube.com/watch?v=LfDYGanMi6Q http://vcell.ndsu.edu/animations/downloads/subtitled/ProteinTransport_eng.mp4

Přenos proteinu do chloroplastu Podobný mitochondriálnímu transportu Postranslační Vyžaduje energii (ATP) Používá amfipatický helix Translokátory (mají jinou kompozici než mt TOM a TIM komplexy Přenos přes vnitřní membránu není poháněn gradientem H+, ale GTP/ATP hydrolýzou Transport do thylakoidů je závislý na gradientu H+

Přenos proteinu do chloroplastu

Přenos proteinu do thylakoidu 1. Sec dráha používá homologní translokátory jako baktérie 2. Homolog signální rozeznávací částice (ER) 3. Import závislý na přítomnosti dvou Arg v signální sekvenci 4. Spontánní dráha Figure 12-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

MOLECULAR BIOLOGY – Protein structure & function Enzymes can modify proteins by the addition of molecular moieties i.e. ‘post-translational modifications’ Although the genetic code specifies for the incorporation of only 20 amino acids into proteins, these can be extensively modified to confer differing functionalities by: Phosphorylation Glycosylation Methylation N-acetylation N-myristoylation Deamination S-prenylation Sumoylation S-pamitoylation GPI-anchoring Lipidation Ubiquitination S-Nitrosylation Lipidation