Elektromigrační metody

Separační techniky Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich rozdělení v jedné fázi v určitém směru. „Rovnovážné“ – látky jsou převáděny přes fázové rozhraní dostatečně rychle Separační techniky „Nerovnovážné“ – látky jsou děleny na základě rozdílných rychlostí transportu „Rovnovážné techniky“ GC, LC, PC, SFC, extrakce, spolusrážení, frakční krystalizace, rektifikace, destilace, sublimace „Nerovnovážné techniky“ Sedimentace, filtrace, ultrafiltrace, centrifugace, elektrostatická depozice, elektrodialýza, FFF, gelová a papírová elektrolýza, separace na molekulových sítech, kapilární elektroforéza „Kombinace rovnovážných a nerovnovážných technik“ Elektrochromatografie, micelární elektrokinetická chromatografie

Elektromigrace = nerovnovážná separační technika Pohyb nabitých částic v kapalném prostředí vyvolaný vložením vnějšího stejnosměrného pole. Kapalné prostředí musí být vodivé tj. NE deioinizovaná VODA Elektromigrace = nerovnovážná separační technika Migrace nabitých částic (iontů, iontových asociátů, nabitých komplexů) v elektrickém poli je možná v roztocích elektrolytů, nejčastěji v PUFRECH Použitý elektrolyt, případně pufr = pracovní elektrolyt (background electrolyte, carrier electrolyte) plní podobnou úlohu jako mobilní fáze v kapalinové chromatografii vyplňuje separační lože na jeho složení závisí úspěšná analýza zajišťuje vodivé spojení celého separačního systému.

Analytická využitelnost elektromigrace Nabité částice ve stejnosměrném elektrickém poli se pohybují směrem k opačně nabité elektrodě určitou rychlostí, která je pro nabité částice různých látek různá = tj. tento fakt je možné využít k analytickým i preparativním účelům. Vedení elektrického proudu v kapalinách (roztocích elektrolytů) V kovech je vedení elektrického proudu zprostředkováno pohybem elektronů (uniformní částice s velmi malou hmotností). V roztocích elektrolytů je vedení elektrického proudu zprostředkováno všemi přítomnými kationty a anionty, přičemž velikost (hmotnost) těchto částic může nabývat malých hodnot (pro solvatované protony až po velké komplexy proteinů nebo polynukleotidů).

Vedení elektrického proudu je u elektrolytů popisována Ohmovým zákonem U = I.R Konduktivita G = 1/R Kohlrausch – „vodivost roztoku je dána nezávislou migrací iontů“ Katoda Anoda - - + + Při průchodu proudu roztokem elektrolytu migrují anionty směrem k anodě a kationty směrem ke katodě v ekvivalentním moižství nezávisle na sobě. Elektroneutralita roztoku zůstává zachována díky elektrolýze probíhající na obou elektrodách.

Na obou elektrodách současně probíhá elektrolýza, jejímž výsledkem je produkce protonů na anodě a produkce hydroxoniových iontů na katodě, což zajišťuje zachování elektroneutrality. Elektrolýzou, ale může dojít ke změně pH pracovního elektrolytu, tzn. s výhodou se využívá pufrů, které tyto změny vyrovnávají a navíc se používají inertní platinové elektrody ve tvaru tenkých drátků, kde dochází k potlačení elektrolýzy (malý povrch elektrody).

Instrumentace elektromigračních technik kapilární techniky x plošné techniky Separace probíhá v kapiláře Separace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC) + Zdroj napětí Pufr Detektor Jamky pro vzorky - + - Gel Elektrody Pufr outlet inlet

Instrumentace elektromigračních technik kapilární techniky x plošné techniky Separace probíhá v kapiláře Separace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC)

Instrumentace elektromigračních technik kapilární techniky x plošné techniky Separace probíhá v kapiláře Separace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC)

Plošné i kapilární elektromigrační techniky jsou založeny na stejném principu tj. separace probíhá na základě rozdílných migrací analytů v separačním prostředí, které se ale liší. Separační prostředí gelová a papírová kapilární roztok elektrolytu (pufru) gelové médium + elektrolyt papír + elektrolyt gelové médium + elektrolyt Separace probíhá v kapiláře (i.d. 25 až 100 m). Napětí vkládáné mezi elektrody 0 – 30 kV). Separace malých iontů i makromolekul. Složitější instrumentace, lepší účinnost separace, snadná detekce, automatizace Separace probíhá v gelovém prostředí vytvořeném mezi dvěma deskami nebo na papíru Napětí vkládáné mezi elektrody 0 – 200 V). Separace pouze makromolekul Jednoduchá instrumentace, nízká účinnost, nutnost off-line detekce X

Využití nanotechnologií Mikroseparační technika – Elektroforéza na čipech „Lab on chip“ Využití nanotechnologií Celá separace může proběhnout na chipu s křemíkovými kanálky během několika sekund.

Stejná instrumentace, různé principy separace analytů Kapilární elektromigrační techniky Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Kapilární izotachoforéza (CITP) Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Kapilární elektrochromatografie (CEC) Stejná instrumentace, různé principy separace analytů

Základní popis elektromigrace, rychlost migrace, mobilita Katoda Anoda - - + + Do tohoto systému vyplněného roztokem elektrolytu nadávkujeme velmi malou zónu vzorku obsahující ionty. - + + + + + + + IR1 IR2 Situace se změní v případ sériově zapojených odporů U = IR1 + IR2

Separace probíhá po vložení stejnosměrného napětí mezi anodu a katodu. E … intenzita elektrického pole U... Napětí vkládané mezi elektrody L…celková délka separačního prostředí (celková délka kapiláry) L Katoda Anoda - + l l…efektivní délka kapiláry (vzdálenost, kterou analyt urazí při migraci od místa injekce do bodu detekce) Část L – l se na separaci nepodílí

- + - + Rychlost migrace nabité částice t = 0, E = 0 Fe Ff t = t1, E = E1 + + + Po vložení napětí mezi elektrody začnou na nabitou částici působit dvě síly, působící navzájem opačně: elektrická Fe odporová, třecí Ff

Elektrická síla Odporová síla Mezi rychlostí pohybu a intenzitou elektrického pole je přímá úměrnost me…elektroforetická mobilita tm…migrační čas

Experimentálně měřenou veličinou je migrační čas tm, ze kterého lze vypočítat pouze tzv. zdánlivou mobilitu μav. NENÍ tedy fyzikální konstantou  Výpočet zdánlivé mobility z migračního času Zdánlivá mobilita je vektorovým součtem efektivní mobility a mobility EOF Zbavit se všech omezujících závislostí  Limitní (iontová) mobilita mlim = f (T) Fyzikální konstanta  tabelována

Jak na to? Měřit při konstantní teplotě Měřit při jednotkové viskozitě (nebo extrapolovat na jednotkovou) Extrapolovat na nulovou iontovou sílu Měřit při 100% disociaci (protonizaci) analytu (a = 1) Eliminovat vliv elektroosmotického toku (změřit mobilitu EOF) Efektivní mobilita – definovatelná pro slabé elektrolyty a analyty podléhající vedlejším komplexačním nebo asociačním rovnováhám slabá kyselina (HA) solv (H+)solv + (A-)solv HA HA A- HA H+ A- pH HA HA H+ solvent

Migrovat budou pouze ionty A- směrem k anodě, ale protože disociační rovnováha je velmi rychlá, budou se současně k anodě pohybovat neutrální molekuly HA. Rychlost migrace bude, ale závislá na množství disociovaných molekul HA v pracovním elektrolytu (tj. na stupni disociace). Rychlost migrace (efektivní mobilita) je tím větší, čím je větší stupeň disociace a je maximální pro 100% disociaci (protonizaci) Elektroforetická mobilita = f (T, pH, viskozity, složení a koncentrace elektrolytu, stupně disociace analytu, vedlejší komplexotvorné rovnováhy apod.) Analogicky jako pro slabé kyseliny, lze zavést podobnou úvahu i pro slabé báze.

14 Praktický důsledek disociačních rovnováh: Pro migraci v elektrickém poli musí být analyt buď ve formě aniontu nebo kationtu. Oblast protonizace slabých bazí pH < 3 – separace kationtů (slabých bazí) pH 3 až 9 – separace aniontů i kationtů pH pH > 9 – separace aniontů (slabých kyselin) Oblast disociace slabých kyselin 14

Sekvenace lidského genomu - využití kapilární elektroforézy Sekvenátor DNA = kapilární elektroforéza s fluorescenční detekcí Pro dosažení výsledků sekvenace v reálném čase se využívá 96 kapilár najednou a dávkování probíhá z mikrotitrační destičky

Takto vypadá záznam z detektoru a vyhodnocení probíhá pomocí počítače.

Pro elektroforetickou separaci je nutné, aby analyty byly nabité (anionty, kationty, komplexy nebo asociáty s výsledným nenulovým nábojem). Neutrální (a hydrofobní) analyty lze separovat elektroforeticky, pomocí micelární fáze. Všechny elektromigrační metody umožní pouze separaci analytů, ale neumožní detekci, tj. podobně jako u chromatografických metody je nutno zařadit detektor pro detekci separovaných analytů. On-line detekce Kapilární elektromigrační metody Off-line detekce On-line detekce = detekce probíhá na místě před koncem kapiláry (různá celková délka kapiláry a efektivní délka kapiláry) L Katoda Anoda - + l Detekční okénko

Separační prostředí v kapilárních technikách Křemenná kapilára – vyrobená z taveného křemene (nejčastěji používaná) Teflonová kapilára – vyrobená z teflonu Křemenná kapilára – nejčastěji 25 až 100 mm vnitřní průměr, vnější průměr 375 mm. Pro snadnou manipulaci a snadný odvod tepla generovaného průchodem proudu uvnitř kapiláry je kapiláry pokryta polyimidem. Délka v desítkách cm až do 1 m. Pro on-line detekci je někdy nutné odstranit vrstvu polyimidu, tak aby mohl vzniklým detekčním okénkem procházet např. paprsek UV-Vis, nebo fluorescenčního záření. Pro on-line vodivostní detekci není nutné polyimid odstraňovat. V případě teflonové kapiláry není nutné vytvářet detekční okénko (teflon je UV-Vis transparentní).

Nejčastější typy detekcí UV-Vis (DAD) detekce Fluorescenční detekce Vodivostní detekce Hmotnostní spektrometrie Ampérometrická detekce Radiometrická detekce NMR, cirkulární dichroismus, refraktometrie, IR spektrometrie Nejčastěji využívané detekce Detekci je nutné zvolit podle typu analytu, podle množství informací, které je možné danou detekcí získat, podle náročnosti instrumentace, ceny apod. Absolutně nejčastěji je CE spojována s UV-Vis (Detektor diodového pole, DAD) detektorem

Schématické možnosti spojení CE technik s ostatními separačními a detekčními technikami

Detektor diodového pole – diode array detector Seskupení několika tisíc fotodiod, které úplně pokrývají vymezený interval vlnových délek. Foton po dopadu na fotodiodu vyvolá fotoelektrický proud. Tento proud vybije kondenzátor, se kterým je dioda spojena. Měří se proud, který je nutný na opětné dobití kondezátoru. Vyhodnocení signálů provádí počítač. DAD detektor umožňuje snímat signál při jedné nebo několika vybraných vlnových délkách a navíc ukládá do paměti absorpční spektrum detekovaného analytu. Podobný výstup má i tzv. CCD detektor (Charge Coupled Device – CCD) – snímač s nábojovou vazbou. Schéma DAD detektoru 3D záznam (t, A, λ)

Typy detekčních technik využívaných v CE