Regulace exprese genu pro erythropoetin Jaroslav Halamka

Erythropoetin glykoproteinový hormon tvořící se převážně v intersticiu ledvin (fibroblast–like typ 1 intersticiálních bkách peritubulárních prostor cortexu a vnější dřeně) hlavní hormon hemopoézy (erythro-, trombo- a myelopoézy) jeho receptory jsou fyziologicky lokalizovány i mimo hematopoetickou tkáň (CNS, játra, endothel, uterus) v krvi funguje jako aktuální ukazatel míry hypoxie může být růstovým faktorem některých nádorů

EPO člen rodiny třídy I cytokinů globulární struktura se 4 α–helikálními řetězci molekulová hmotnost 30,4 kDa řetězec 165 AK cca 40% molekuly je tvořeno cukry, in vivo prodlužují biologický poločas molekuly nejdůležitější pro stabilizaci jsou N–oligosacharidy na asparaginech 24, 38 a 83

EPO-receptor a signalizace EPO-R nemá vlastní kinázovou aktivitu signalizace se odehrává prostřednictvím EPO-R asociovanou JAK (Janusova kináza) JAK-2 kináza fosforyluje STAT-5 (Signal Transducer and Activator of Transcription) kaskáda JAK-2/STAT-5 řídí buněčnou proliferaci a maturaci hematopoetických buněk minoritní cesty signalizace jdou cestou RAS a PI3K kináz – mají nezastupitelnou úlohu v organizaci buněčného cyklu

Aktivace a deaktivace JAK/STAT cesty © Ward et al.

Exprese EPO–genu hladinou kyslíku řízená exprese hlavním regulátorem v kaskádě jsou proteiny HIF (Hypoxia–Inducible Factor) HIF–1, HIF–2, HIF–3 HIF – rodina PAS (Drosophila Period, ARNT and the Drosophila Single-minded proteins) intracelulárních oxygen–reagujících proteinů HIF–1 a HIF–2 jsou pozitivní regulátory exprese HIF–3 negativní regulátor exprese (také GATA–2 a NFκB, ale ty nepatří do rodiny HIF)

HIF–1 skládá se ze dvou podjednotek – α a β (heterodimér) se strukturou helix–loop–helix–PAS doména α podjednotka (cca 120 kDa) je v cytosolu a je oxygen–labilní; 14q21–q24 β podjednotka (91–94 kDa) je nukleární, dimerizuje s HIF–1α i HIF–2α podjednotkou, kyslík independentní; je identická s ARNT (Aryl–hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator) – podjenotka dimerizace s dioxynovým receptorem AHR (Aryl Hydrocarbon Receptor), míra její exprese a degradace je v průběhu času kontinuální; 1q21

HIF–1 proteinové domény © Déry et al.

HIF-1α při normooxii při normoxii jsou v bce jen minimální množství, její maximální syntéza následuje do 30 min od počátku hypoxie (produkci stimuluje kobalt a deferroxamin–jiný mechanismus indukce exprese) při dostatku kyslíku podjednotka podléhá oxidaci (hydroxylaci) specifickou prolyl–hydrogenasou (PHD – α–ketoglutarát–FeII–dependentní dioxygenasa) na pro402 a pro564, k ochraně před kyslíkovými radikály slouží askorbát

HIF-1α při normooxii PHD–1 (vyskytuje se výhradně v jádře) a PHD–3 (je v jádře i cytosolu) hydroxylují prolin PHD–2 (FIH, asparaginyl–hydroxylasa) je v cytoplasmě, hydroxyluje asn803–brání vytvoření heterodiméru s β–podjednotkou po hydroxylaci pro402 (je v ODD – Oxygen–dependent Degradation Domain) se naváže pVHL (von Hippeln–Lindau protein) vazbou na pVHL je umožněna ubiqitinizace a likvidace v proteasomu

HIF-1α při normooxii © by Elsevier Sciece

EPO gen nejaktivnější je v bkách intersticia ledvin a hepatocytech 2 regulační oblasti – tzv. HRE (Hypoxia Response Element) regulační faktory se váží na LIE (Liver–Inducible Element), v ledvinách dojde ke switchi – EPO pre–mRNA může být přepsána

HIF-1 při hypoxii α–podjednotka vstupuje do jádra, kde tvoří heterodimér s β–podjednotkou dimér přisedá na HBS (HIF Binding Site) LIE oblasti genu (specifické pořadí nukleotidů 5‘–TACGTGCT–3‘) ke komplexu se naváže protein p300 a přes něj HNF (Hepatocyte Nuclear Factor) vytvoří se switch s 5‘–koncem genu (oblast KIE, Kidney–inducible Element) odkud začíná traskripce EPO pre–mRNA

© Fandrey

Switch EPO genu © Hachachka & Rupert

Aktivace exprese cAMP kaskádou fosforylují se HIF–1α podjednotky (aktivace) nebo přímo transkripční faktory jádra (aktivace s minimem aktivního HIF–1α, pomalejší) jde cestou p42/p44–MAP kinázou probíhá i při hypoxii a má protektivní charakter na reakce – fosforylací thr796 je znemožněna hydroxylace asn803 FIH (PHD–2) fosforylace usnadňuje dimerizaci a tvorbu iniciačních komplexů vč. switche

Fosforylační kaskáda © Fisher & Brookins

Normooxie/Hypoxie © Déry et al.

Závěr EPO je esenciálním faktorem krvetvorby má nezastupitelné funkce při embryogenezi a organogenezi zejm. CNS („EPO knock–out“ myši hynuly během intrauterinního vývoje, „EPO knock–down“ myši se rodily s těžkými malformacemi CNS a umíraly několik dní po porodu) faktory tvorby EPO (zejm. HIF–1) jsou intenzivně zkoumány i v souvislosti s jinými orgánovými soustavami – stimulace tvorby kapilár (výzkum v onkologii)

Závěr tvorba faktorů i samotného EPO je závislá na hladině kyslíku v tkáních geny pro tvorbu faktorů nebo EPO jsou trvale exprimovány jen v bkách intersticia ledvin a hepatocytech hypoxie vyvolá přechodnou expresi EPO genu i v jiných orgánech (hlavně CNS) – EPO má protektivní vliv na orgány v krátkodobé hypoxii

Závěr jeho produkce má charakter autokrinní, parakrinní a endokrinní EPO se dnes využívá jako rekombinantní RHuEPO terapeuticky při poruchách tvorby vlastního EPO, anemie produkce roste s nadmořskou výškou (větší saturace tkání kyslíkem v řidším vzduchu) zneužití = doping

Literatura Semenza GL: O2-regulated gene expression: transcriptional control of cardiorespiratory physiology by HIF-1; J Appl Physiol; 2004 Mar; 96(3):1173-7; discussion 1170-2 Jelkmann W: Molecular biology of erythropoietin; Intern Med; 2004 Aug; 43(8):649-59 Déry MA, Michaud MD, Richard DE: Hypoxia-inducible factor 1: regulation by hypoxic and non-hypoxic activators; Int J Biochem Cell Biol; 2005 Mar; 37(3):535-40

Literatura Farrel F, Lee A: The erythropoietin receptor and its expression in tumor cells and other tissues; Oncologist; 2004; 9 Suppl 5:18-30 Fandrey J: Oxygen-dependent and tissue-specific regulation of erythropoietin gene expression; Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol; 2004 Jun; 286(6):R977-88 Fisher JW: Erythropoietin: physiology and pharmacology update; Exp Biol Med (Maywood); 2003 Jan; 228(1):1-14 Hochachka PW, Rupert JL: Fine tuning the HIF-1 'global' O2 sensor for hypobaric hypoxia in Andean high-altitude natives; Bioessays; 2003 May; 25(5):515-9