D. Mikulenková Morfologicko - cytochemická laboratoř, ÚHKT, Praha, Diferenciální diagnostika leukocytóz v morfologické laboratoři - maligní leukocytózy D. Mikulenková Morfologicko - cytochemická laboratoř, ÚHKT, Praha,

Definice leukocytózy Zvýšená hodnotu počtu leukocytů nad normu: dospělí WBC: 4 – 10 . 109 /l

Hematopoeza

Neutrofílie Bakteriální infekce Chronické virové infekce Růstové faktory Myeloproliferativní onemocnění MDS/CMPD

blast promyelocyt tyč tyč myelocyt myelocyt bazofil tyč tyč

myelocyt promyelocyt metamyelocyt metamyelocyt metamyelocyt promyelocyt promyelocyt metamyelocyt metamyelocyt metamyelocyt myelocyt metamyelocyt myelocyt metamyelocyt myelocyt promyelocyt metamyelocyt

Lymfocytóza Virové infekce Reaktivní stavy Patologické lymfocytózy

Monocytóza Chronické infekce Poruchy imunity Hemolytické anémie MDS, MDS/CMPD AML

Eozinofílie Reaktivní (alergie, polékové, parazitární infekce, GIT, nádorové…) HES Neoplazmatické – CEL, AML, CML

Mladší eozinofily monocyt

Bazofílie Neoplastické (chronické myeloproliferativní onemocnění, MDS, AML…) Alergie, hypotyreóza, ulcerózní kolitida

Rozpočet leukocytů Doporučení ČHS – www.hematology.cz/doporuceni-chs-meze.php Absolutní počet Relativní počet Neutrofily 2,00 – 7,00 . 109/l 45 – 70 % Lymfocyty 0,80 – 4,00 . 109/l 20 – 45 % Monocyty 0,08 – 1,20 . 109/l 2 – 12 % Eozinofily 0,00 – 0,50 . 109/l 0 – 5 % Bazofily 0,00 – 0,20 . 109/l 0 – 2 %

Hodnoty DIF z analyzátoru 5- populační diferenciál (6- populační) WBC + bazo DIF Perox (IMI, WNR, WDF, WPC)

Hodnoty DIF z analyzátoru Fluorescenční průtoková cytometrie (DIFF) - měření velikosti a analýza vnitřní struktury leukocytů na základě vyhodnocení změn parametrů procházejícího laserového paprsku buňkou specificky obarvenou na přítomnost nukleových kyselin DNA a RNA: velikost buňky (Forward Scatter) hustota vnitřní struktury buňky (Side Scatter Light) intenzita fluorescenčního úměrná aktivitě buňky a nepřímo úměrná stupni vyzrálosti buňky (Side Fluorescence Light)

???

myeloperoxidáza Akutní myeloidní leukemie bez známek vyzrávání (AML M1)

Hodnoty DIF z analyzátoru Optická metoda + myeloperoxidázová aktivita leukocytů: DIF- peroxidázový kanál velikost buňky na ose y 1 Noise 2 NRBC 3 Shluky destiček 4 Lymfocyty a bazofily „Large Unstained Cells“ (velké MPO negativní buňky) Monocyty Neutrofily 8 Eozinofily

DIFF – PEROX – průtoková cytometrie Cytochemická klasifikace dle myeloperoxidázové aktivity: Buněčný typ Myeloperoxidáza Myeloblasty -, ½+ Promyelocyty 3+ Myelocyty 3+ Metamyelocyty 3+ Tyče 2-3+ Neutrofily 2-3+ Eozinofily 4+ Bazofily - Lymfoblasty - Prolymfocyty - Lymfocyty - Atypické lymfocyty - Monoblasty - Promonocyty - Monocyty 1+ Plasmatické buňky - NRBC - PEROX DIF se velmi podobá tomu, co vidíte v mikroskopu

Akutní myeloidní leukemie bez známek vyzrávání (AML M1) 89% blastů MPO+ 92% blastů

Burkittova leukemie/lymfom (dle FAB ALL L3) MPO negativní 50% lymfoblastů

I. Podezření na maligní leukocytózy Z analyzátorového DIF: Neutrofílie s posunem doleva (CML, MDS/CMPD…) Lymfo-monocytóza + anémie + trombocytopenie (akutní leukemie) Lymfocytóza (leukemizované lymfoproliferativní onemocnění) (LUC – peroxidáza negativní blasty, velké lymfocyty) Jen pomocné hodnocení!!!

+ = = +

hruška x jablko ???

II. Podezření na maligní leukocytózu Z mikroskopického hodnocení nátěru periferní krve: přítomnost blastických elementů (myeloblasty, monoblasty, leukemické promyelocyty, lymfoblasty…) přítomnost patologických lymfocytů posun doleva až k blastům, leukoerytroblastický obraz atypie erytrocytů, fragmentocyty snížený počet a atypie trombocytů

MYELOBLAST – agranulární (I. typu)

MYELOBLAST – granulární (II. a III.typ)

LYMFOBLAST

LYMFOBLASTY MYELOBLAST

LYMFOBLAST (L3)

MONOBLAST ALFA-NAFTYLBUTYRÁTESTERÁZA

LEUKEMICKÝ PROMYELOCYT

III. Podezření na maligní leukocytózu Diagnóza potvrzena: z cytomorfologického hodnocení aspirátu KD vč. cytochemického hodnocení FCM vyšetření subcelulární vyšetřovací metody histopatologický rozbor kostní dřeně vč. imunohistochemie

III. LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA NA MORFOLOGICKO-CYTOCHEMICKÉ LABORATOŘI Hodnoty KO Nátěr PK: hodnocení 200 jaderných buněk, zhodnocení červené řady a destiček Nátěr aspirátu KD: zhodnocení celularity, 500 jaderných buněk, trilineární hematopoeza Cytochemické vyšetření: myeloperoxidáza (MPO), esterázy (ANBE, ANAE, NACE), Perlsova reakce na železo, PAS reakce, MPO- eoz, toluidinová modř

Maligní leukocytózy Akutní leukemie Chronické leukemie Leukemizované lymfomy

IV. KLASIFIKACE AKUTNÍCH LEUKEMIÍ WHO KLASIFIKACE TUMORŮ HEMATOPOETICKÉ A LYMFOIDNÍ TKÁNĚ z r. 2008 Akutní myeloidní leukemie Malignity z prekurzorových B - a T- buněk Akutní leukemie obtížně klasifikovatelné

IV.A. AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKEMIE AML s rekurentními translokacemi AML s myelodysplastickými změnami (z MDS, MDS/MPN, MDS s cytogenetickými změnami, či bez předchozí anamnézy) Therapy- related myeloidní neoplazma (alkylační cytostatika, inhibitory topoizomerázy, jiné) AML jinak nekategorizované (MO-M7, akutní bazofilní leukemie, akutní panmyelóza s fibrózou) Myeloidní sarkom (histologie) Myeloidní proliferace u Downowa syndromu Neoplazma z blastických plazmocytoidních dendritických buněk

IV.A. AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKEMIE AML s rekurentními translokacemi t(8,21)(q22,q22) - RUNX1-RUNX1T1 inv(16)(p13q22) nebo t(16,16) - CBFbeta- MYH11 t(15,17)(q22,q21) - PML-RARA, varianty t(9,11)(p22,q23) - MLLT3-MLL t(6,9)(p23,q34) - DEK-NUP214 inv(3)(q21,q26.2) nebo t(3,3)(q21,q26.2) RPN- EVI1 t(1,22)(p13,q13) – RBM-MKL1 AML s mutací NPM1 AML s mutací CEBPA

IV.B. PREKURZOROVÉ LYMFOIDNÍ LEUKEMIE Prekurzorová B lymfoblastická leukemie/ lymfom, nezařazená Prekurzorová B lymfoblastická leukemie/ lymfom s rekurentními genetickými abnormalitami t(9,22(, (q34,q11.2) BCR-ABL1 t(v,11q23) MLL přestavba t(12,21((p13,q22) TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) s hyper- či hypodiploidií t(5,14)(q31,q32) IL3-IGH t(1,19)(q23,p13.3) E2A-PBX1(TCF3-PBX1) Prekurzorová T lymfoblastická leukemie/ lymfoblastický lymfom

IV. C. AKUTNÍ LEUKEMIE OBTÍŽNĚ KLASIFIKOVATELNÉ Obtížně klasifikovatelné akutní leukémie leukémie Akutní nediferencovaná Akutní leukémie se smíšeným fenotypem BCR-ABL1 MLL přestavba Akutní leukémie se smíšeným fenotypem B/myeloidní Akutní leukémie se smíšeným fenotypem T/myeloidní jinak nespecifikované Ostatní obtížně klasifikovatelné leukemie

Co musíme umět ! PML/RARA pozitivní akutní myeloidní leukemie - (AML M3) (PK, KD, MPO či NACE) AML s dysplastickými změnami (kompletní cytochemické vyšetření)

Akutní promyelocytární leukemie s t(15,17)(q22,q21) Blasty tvoří obvykle méně než 20% Přítomnost leukemických promyelocytů i v nátěru periferní krve Specifické cytogenetické a molekulárně genetické abnormality Prognostický faktor - počet leukocytů, DIC Hypergranulární (typická) a mikrogranulární forma APL s variantními translokacemi t(11,17) PLZF/RARA, t(5,17) NPM/RARA

AML M3 – hypergranulární forma

AML M3 – mikrogranulární forma

Reparace po útlumu

AML s myelodysplastickými změnami Většinou pancytopenie Dysplastické změny ve 2 a více řadách u více než 50% buněk Dyserytropoeza - multinuklearita, pulverizace, karyorexe, N/C asynchronie, megaloidní změny, makroerytroblasty, ringsideroblasty Dysgranulopoeza- patologická granularita, pseudopelgeroidie, abnormality tvaru jádra Dysmegakaryopeza- 3 a více či 50% mikromegakaryocytů, separace jader, hypo- či monolobularita

dyserytropoeza

dysmegakaryopoeza

V. Chronické leukemie Chronická myeloidní leukemie Chronická eozinofilní leukemie Chronická lymfatická leukemie Prolymfocytární leukemie…

CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKEMIE Ph+, bcr/abl pozitivita NAP snížený u 95% (v chronické fázi) Spleno- (hepato)megalie, infiltrace uzlin, měkkých tkání 3 vývojové fáze PK: leukocytóza s posunem doleva, méně než 10% blastů, normochromní a normo- nebo makrocytární anémie, trombocytóza, bazofílie, eozinofílie, monocytóza (u p190) KD: hypercelulární, s hyperplazií granulo- a často i megakaryopoezy, zvýšeně bazofilní a eozinofilní prekurzory, megakaryocyty menší s hypolobací jádra (trpasličí), megaloidní změny Fáze akcelerace - progrese leukocytozy a splenomegalie, perzistující trombocytopenie či trombocytóza, v KD dysplastické změny, bazofílie Blastický zvrat - nejčastěji myeloidní, lymfoblastový, biklonální

CML periferní krev

CML chronická fáze - kostní dřeň

CML chronická fáze – kostní dřeň

CML megakaryocyty

CML pseudoGaucherovy buňky

CML sea- blue makrofágy

CML fáze akcelerace Blasty 10-19% jaderných buněk v PK či KD Periferní bazofílie více než 20% Perzistující trombocytopénie či trombocytóza Progrese splenomegalie a leukocytózy Cytogenetický průkaz klonální evoluce Dysplázie granulo- a megakaryopoezy

CML fáze akcelerace – periferní krev

CML fáze akcelerace – kostní dřeň

CML blastický zvrat Blasty více než 20% v PK či KD Proliferace blastů v extramedulární lokalizaci Agregáty blastů v trepanobiopsii 70% myeloidní - neutrofilní (eozinofilní, bazofilní, monocytární, megakaryocytární, erytroidní) Lymfoblastový, bilineární, bifenotypový

CML myeloidní zvrat

CML lymfoblastový zvrat

CML megakaryoblastický zvrat

Charcotovy- Leydenovy krystaly

VI. Podezření na patologickou lymfocytózu Dle hodnot KO: Leukocytóza s lymfocytózou Normální HGB (anémie) Normální počty trombocytů (trombocytopenie)

VI. Podezření na patologickou lymfocytózu Dle mikroskopického hodnocení nátěru periferní krve: Přítomny patologické lymfocyty, lymfoblasty ALL CLL, PLL, leukemizované lymfomy, (myelom)

Morfologické dělení atypických lymfocytů Reaktivní (aktivované) lymfocyty – lymfocyty reagující na infekční agens Atypické (patologické) lymfocyty – lymfocyty atypické velikostí, tvarem a konturou jádra, charakterem chromatinu, atypickou barvitelností, prostorností, či konturou cytoplazmy (ALL, B - a T - lymfoproliferativní onemocnění, např. CLL, PLL, jiné leukemizované lymfomy) Lymfoblasty

A. Reaktivní lymfocytózy (EBV, CMV…) jádro kulaté, oválné, členité chromatin „rozvolněný“ početnější jadérka cytoplazma bohatá, sytěji homogenně bazofilní, více v okrajích, často nepravidelná kontura ojediněle jemná azurofilní granula a/nebo vakuoly

Plazmatická buňka Reaktivní lymfocyt

B. Maligní lymfocytózy Klonální leukemizovaná onemocnění z B- či T – lymfocytů, z NK buněk Akutní lymfoblastové leukemie Chronické lymfocytární leukemie Leukemizované lymfomy

WHO klasifikace 2008 I. Neoplazma z lymfoidních B- a T- prekursorů II. CLL/SCL, B -PLL, lymfoplazmocytární lymfom/Waldenströmova makroglobulinémie, splenický lymfom z marginální zóny, vlasatobuněčná leukemie, malignity z plazmatických buněk, folikulární lymfom, lymfom z plášťových buněk, DLBCL, Burkittův lymfom/leukemie, extranodální lymfom z B – buněk, nodálním lymfom z B – buněk marginální zóny, mediastinální velkobuněčný lymfom, intravaskulární velkobuněčný lymfom, lymfomatoidní granulomatóza III. M. Hodgkin IV. T- PLL, T- LGL, agresivní leukemie z NK buněk, leukemie/lymfom z T- buněk u dospělých (HTLV-1), extranodální lymfom z NK/T- buněk nazálního typu, intestinální lymfom z T- buněk, hepatosplenický T-lymfom, panikulitický podkožní T-lymfom, blastický NK lymfom, Mycosis fungoides a Sezaryho syndrom, angioimunoblastický T- lymfom, primární kožní CD30 pozitivní T- lymfoproliferativní onemocnění, periferní T-lymfom nespecifikovaný, anaplastický velkobuněčný T-lymfom

Chronická lymfocytární leukemie nejčastější leukemické onemocnění dospělých v západním světě věk nad 50let, převaha mužského pohlaví nebolestivá generalizovaná lymfadenopatie s lymfocytózou z B lymfocytů (splenomegalie, anémie, trombocytopenie, opakované infekty)

Folikulární lymfom (FCL) Neoplazma z centrocytů a centroblastů zárodečného centra lymfatických folikulů LU, slezina, kostní dřeň, periferní krev, Waldayerův okruh

Lymfom z plášťové zóny (MCL) Neoplazma z malých až středně velkých B-lymfocytů plášťové zóny lymfatických folikulů Lymfadenopatie, hepato-splenomegalie, GIT, Waldayerův okruh

Splenický lymfom z marginální zony (SMZL) Neoplazma z malých B-lymfocytů Slezina (marginální zona bílé pulpy), (kostní dřeň), periferní krev V PK: vilózní lymfocyty (SLVL), plazmocytoidní lymfocyty

Závěr – I. Morfologické zhodnocení buněk v nátěru PK v některých případech pomůže stanovit diagnózu (u lymfocytóz jsou morfologické změny patologických lymfocytů v nátěru PK výraznější – velikost buněk, uniformita populace, atypie jádra a cytoplazmy)

Závěr – II. Definitivní diagnóza je stanovena z morfologicko-cytochemického hodnocení aspirátu kostní dřeně s podporou FCM vyšetření u pacienta s patologickou lymfocytózou je definitivní stanovena dg. z FCM a histopatologického vyšetření (KD, uzliny…) Subcelulární vyšetřovací metody (cytogentika a molgen) upřesní diagnózu a určí prognózu

Závěr – III. Ne každá lymfo-monocytóza v hodnotách KO je pravá lymfo-monocytóza!!! Ne každá lymfocytóza v hodnotách KO je pravá lymfocytóza!!! Nutné je pečlivé morfologické zhodnocení nátěru PK, které ukáže směr

Děkuji za pozornost