Vysokomolekulární látky v buňce Replikace, transkripce a translace DNA

Vysokomolekulární organické látky Polysacharidy Po stránce kvantitativní nejčastější biopolymer živých soustav Součástí buněčných stěn a mezibuněčné hmoty, energetická zásoba a vazba na bílkoviny jako součást důležitých makromolekul Monomerem polysacharidových makromolekul jsou monosacharidy (D-glukóza, D-fruktóza, D-manóza..) nebo deriváty monosacharidů (uronová kyselina..) Je-li v řetězci jen jeden druh monosacharidu – homopolymery, je-li zastoupeno více druhů - heteropolymery

Vysokomolekulární organické látky Bílkoviny (proteiny) Vznikají kondenzací aminokyselin peptidovými vazbami, páteří je polypeptidový řetězec primární struktura proteinů – obsahují 20 základních neboli standardních aminokyselin (kódované aminokyseliny), posloupnost, pořadí, sled, sekvence) aminokyselin v polypeptidovém řetězci je tzv. primární struktura proteinu aminokyseliny jsou organické kyseliny, obsahující kromě jedné až dvou karboxylových skupin (-COOH) také jednu až dvě skupiny aminové (-NH2) ze všech aminokyselin se jich vyskytuje v živé hmotě jen 20

Vlastnosti určité bílkoviny nejsou určeny pouze aminokyselinovým složením, ale i jejich pořadím čili sekvencí v peptidovém řetězci val. ala. cys. ala. cys. val. val. cys. ala. cys. val. ala. ala. v al. cys. cys. ala. val. peptidový řetězec o 300 aminokyselinách – 19390 různých sekvencí Poprvé určil strukturu molekuly inzulínu F. Sanger v roce 1953

Oligopeptidy – několik nebo několik desítek aminokyselin důležité biologické funkce, zejména regulační (např. některé hormony) nebo jsou součástí složitějších makromolekul (tetrapeptidy v mureinu) Bílkoviny (proteiny) – řetězec je tvořen větším počtem aminokyselin (několika sty) molekulová hmotnost –od 10 000 až 50 000 bílkoviny fibrilární x globulární

sekundární struktura proteinu – polypeptidový řetězec je svinutý u každého proteinu charakteristickým způsobem, tzv. sekundární struktura proteinu je udržována vodíkovými vazbami mezi skupinami C=O a –NH- peptidové vazby -helix – řetězec je šroubovitě stočen  struktura, zvaná též skládaný list terciální struktura – prostorové uspořádání jednotlivých úseků - ligandy

Podjednotkové bílkoviny složeny z většího počtu menších molekul, z více polypeptidových řetězců (podjednotek) podle počtu – dimerní, tetramerní… vzájemné prostorové uspořádání bývá označené jako kvarterní struktura bílkovin příkladem – enzymy, myoglobin, protilátky, kapsidy virů

Funkce bílkovin v buňce Strukturální, metabolickou a informační Strukturální bílkoviny: ty bílkoviny, které jsou součástí buněčných struktur – „stavební kameny“ samostatné nebo ve spojení s jinými biopolymery – polysacharidy..

Funkce bílkovin v buňce Enzymové bílkoviny – enzymová katalýza enzymy urychlují průběh chemických reakcí enzymy umožňují průběh i těch chemických reakcí, které by vůbec probíhat nemohly specifita enzymové katalýzy určuje, které z možných chemických reakcí skutečně probíhat budou chemické reakce mohou být velmi přesně regulovány zásahem do katalytické aktivity enzymů Všechny enzymy jsou globulární bílkoviny Za katalytickou funkci odpovídá pouze část molekuly – aktivní centrum – to je dáno buď souvislou frekvencí několika aminokyselin nebo častěji terciální konfigurací molekuly E + S  ES  E + produkt

Enzymy vykazují dvojí specifitu: funkční – vyjadřuje chemickou reakci, kterou enzym katalyzuje – hydrolýza, fosforylace, oxidace.. substrátová – vyjadřuje chemickou sloučeninu, na kterou je chemická reakce katalyzována

Informační bílkoviny dvojí roli: jako signály, které přenášejí informaci jako receptory, které mohou signál přijímat a event. transformovat v jiný signál nejdůležitější bílkoviny se signální funkcí – bílkovinné hormony, imunoglobuliny.. imunoglobuliny – vysokomolekulární bílkoviny, které specificky rozpoznají strukturu antigenů

Nukleové kyseliny (DNA, RNA) Tvoří malé procento hmotnosti buňky, avšak svým významem v kódování genetické informace a v její expresi představují zcela nezbytný typ biopolymeru všech živých soustav Monomerem nukleových kyselin jsou nukleotidy – ty se kovalentně spojují v polynukleotidový řetězec Nukleotidy jsou tvořeny: dusíkatá zásada (báze) pentóza kyselina fosforečná

Pentózy (cukr o 5 atomech uhlíku) nukleotidů jsou dvě: D-ribóza – v ribonukleotidech (kyselina ribonukleová – RNA) D-deoxyribóza – v deoxyribonukleotidech (kyselina deoxyribonukleová – DNA) Dusíkaté báze jsou buď: puriny – adenin (A) a guanin (G) pyrimidiny – cytozin (C) thymin (T) a uracil (U)-RNA Kyselina fosforečná: H3PO4 Monomer - nukleotid

Struktura polynukleotidového řetěžce jednotlivé nukleotidy jsou v polynukleotidovém řetězci vázány esterickou vazbou mezi fosfátovou skupinou jednoho nukleotidu a pátým uhlíkem pentózy druhého nukleotidu v ose polynukleotidového řetězce se tedy střídá kyselina fosforečná a pentóza, báze od této osy odstupují 5´ konec a 3´konec

Primární struktura RNA Molekuly RNA jsou tvořeny jedním polyneukleotidovým řetězcem ribonukleotidů s bázemi C, G, A, U – jednovláknová molekula velikost od 10 000 do 100 000 podle funkce v buňce: tRNA (transferová RNA) rRNA (ribozomální RNA) mRNA (mediátorová RNA)

Primární struktura DNA Molekuly DNA jsou tvořeny dvěma polyneukleotidovými řetězci, navzájem komplementárními – dvouvláknová či dvouřetězová či dvoupentlicová molekula – a jsou navzájem spojeny vodíkovými můstky U některých virů – jednovláknová DNA

Párování bází Sekvence nukleotidů v obou řetězcích je na sobě závislá je-li v jednom řetězci cytozin (C), pak ve druhém leží naproti němu vždy guanin (G) – pár C – G je-li v jednom řetězci adenin (A), pak ve druhém leží naproti němu vždy thymin (T) – pár A – T

pár C – G pár A – T

Zastoupení adeninu a thyminu v molekule DNA musí být stejná (A = T) a stejně tak zastoupení cytozinu a gunainu (C = G)

Různě se střídají čtyři dvojice (páry) bází: A – T T – A G – C C – G Teoretický počet různých sekvencí je tedy 4n DNA obsahují řádově tisíce až statisíce nukleotidů, je absolutní počet různých sekvencí obrovský – DNA o molekulové hm. 600 000, tj. asi o 2000 nukleotidech je počet možných kombinací 41000 , což je více, než počet atomů celé sluneční soustavy

Nukleotiy jsou uspořádány do řady za sebou, jejich spojení v řadě zajišťují fosfátové zbytky, které spojují uhlík 3' jedné deoxyribózy s uhlíkem 5' druhé deoxyribózy. Směr vláken se označuje právě podle orientace deoxyribózy v něm, tedy: směr 3´→5´ a opačný směr 5´→3´

Oba řetězce molekuly jsou kolem sebe ovinuty v pravotočivých spirálách šroubovice, vytvářejí -helix Množství DNA v buňce je během celého jejího života stálé (zdvojuje se jen S-fázi interkineze každého buněčného cyklu) a druhově specifické

GENETICKÁ INFORMACE Genetická informace je biochemicky zapsaná zpráva, umožňující živé buňce, resp. organismu, jenž ji obsahuje, realizaci určité vlastnosti (znaku) Každá genetická informace je podle biologicky univerzálního klíče (genetický kód) vepsána v primární struktuře molekuly nukleové kyseliny

Specifická primární struktura molekuly DNA zůstává nezměněna po celý život buňky V průběhu buněčného cyklu se DNA replikuje, tj. z každé její molekuly vznikají molekuly dvě - totožné navzájem Každou z nich dostává při mitóze jedna z obou dceřiných buněk

Podle biologického smyslu: GEN – úsek polynukleotidového řetězce, který kóduje primární strukturu polypeptidu jako translačního produktu nebo se přepisuje do primární struktury tRNA či rRNA Podle biologického smyslu: geny strukturní geny pro RNA

Geny strukturní nesou informaci pro primární strukturu (tj. sekvenci aminokyselin) polypeptidového řetězce tvoří úplnou molekulu bílkoviny (enzymové, strukturní, signální aj.) tvoří podjednotku v kvarterní struktuře bílkoviny podjednotkové informace strukturního genu se vždy realizuje cestou transkripce do mRNA a z ní cestou translace do příslušného peptidového řetězce

délka strukturních genů je různá – dle polypeptidového řetězce geny regulátorové – geny, které kódují primární strukturu polypeptidů působících jako represory nebo jako aktivátory transkripce

Geny pro RNA Geny pro RNA kódují primární strukturu všech molekul RNA, jež nepodléhají translaci jsou to molekuly: tRNA, rRNA a tvz. malé jaderné, jadérkové a cytoplazmatické RNA

Genetický kód „šifrovací klíč“, podle kterého jsou v genech zapsány jejich genetické informace genetická informace je zapsána „abecedou“ o čtyřech písmenech – čtyři nukleotidy (báza) DNA každý gen představuje jedno slovo – řádově o 1000 písmenech – tvořené těmito čtyřmi písmeny ve zcela přesném pořadí

Jednotka genetického kódu – tzv Jednotka genetického kódu – tzv. kodón – sekvence tří po sobě následujících bází v DNA )či po transkripci v mRNA), triplet bází Jeden triplet bází DNA strukturního genu či příslušné mRNA kóduje jednotku informace pro zařazení jedné specifické aminokyseliny do syntetizovaného řetězce proteinového řetězce

Čtyři zúčastněné báze tvoří celkem 43 = 64 různých tripletů 61 z nich kóduje 20 aminokyselin nutných pro výstavbu bílkovin Tři triplety – UAA, UAG a UGA – nekódují žádnou aminokyselinu – jsou to „nesmyslné kodóny“ – značí ukončení translace genetické informace a jsou tedy tečkami za přečteným slovem – genem – nazývají se „terminační kodóny“ Jen dvě aminokyseliny mají po jediném kodónu: methionin (kodón AUG) a tryptofan (kodón UGG) Každá z ostatních 18 aminokyselin je kódována dvěma až šesti ze zbývajících 59 tripletů

Replikace DNA Genetické informace zakódovaná v DNA musí být při každé mitóze beze změny přenášeny do dceřinných buněk; zajišťuje to replikace molekul DNA v S-fázi každého buněčného cyklu

Semikonzervativní replikace DNA Pro syntézu nových makromolekul slouží jako matrice oba polynukleotidové řetězce molekuly mateřské Rychlost je vysoká – 1000- 3000 párů bází za minutu

Každou z obou výsledných replik pak tvoří jeden řetězec z molekuly mateřské a k němu komplementární řetězec nově syntetizovaný – tento způsob replikace se označuje jako semikonzervativní

Syntéza u prokaryota začíná pouze v jednom místě zvaném lokus OriC, odkud pokračuje oběma směry podél kružnicové molekuly DNA U eukaryotické buňky dochází k replikaci na mnoha místech současně – rozsáhlejší genom Body v níž se začíná – iniciační nebo replikační body Úseky náležející k jednomu replikačnímu bodu se nazývají replikony

Vlastní replikace DNA Při vlastní syntéze DNA se obě vlákna původní molekuly začnou od sebe vzdalovat a rozplétat působením enzymu helikázy - rozepínání zipu Do rozevřené DNA se na obě vlákna připojí enzym DNA-polymeráza a vytvoří na každém vlákně krátký úsek RNA (tzv. primér). Na něj se pak napojuje nově vytvořená DNA

Volné nukleotidy se podle principu komplementarity (enzym DNA-polymeráza) začnou přikládat k původnímu (matricovému) vláknu DNA (3’ -> 5’), oproti druhému vláknu (5’ -> 3’) syntetizuje DNA-polymeráza jen krátké fragmenty (tzv. Okazakiho fragmenty)

Kontinuální a diskontinuální replikace DNA DNA-polymeráza umí syntetizovat pouze ve směru 3’ -> 5’ DNA se však rozplétá postupně jen z jedné strany a k syntetizaci dochází prakticky okamžitě, nezbývá jí, než na „špatném“ 5’ -> 3’ řetězci syntetizovat po krátkých úsecích proti směru rozepínání zipu - replikace probíhá semidiskontinuálně (na jednom vlákně kontinuálně a na druhém diskontinuálně) Poté je odštěpen primér a Okazakiho fragmenty následně pospojuje enzym DNA-ligáza

Transkripce a translace

Živé organismy nesou informace pro syntézu pro ně charakteristických proteinů v molekulách DNA Biochemický systém umí využít pouze informaci zapsanou v RNA, proto musí být tyto informace nejdříve přepsány – transkribovány – z DNA do RNA a odtud přeloženy do struktury proteinů

Transkripce genetické informace Transkripce probíhá v jádře buňky (u prokaryot volně v cytoplazmě) Nejdříve se rozplete dvoušroubovice DNA Řetězec, který bude sloužit jako matrice pro transkripci se označuje jako templátový nebo negativní, značí se znaménkem – Skládá se z jednotlivých genů, které jsou přepisovány do mRNA

Každý gen je ohraničen regulačními oblastmi Na počátku se nachází promotor, což je sekvence nukleotidů, jež není přepisována (transkribována) do mRNA, ale na níž nasedá enzym RNA polymeráza (transkriptáza), který začne na již kódující nukleotidy DNA - tzv. transkripční jednotka, připojovat komplementární nukleotidy mRNA (kupříkladu řetězec DNA v podobě A-T-C-G-G se do mRNA přepíše jako U-A-G-C-C)

Když se do mRNA přepíše celý gen, zakončený tzv Když se do mRNA přepíše celý gen, zakončený tzv. terminátorem - regulační oblast, jež zajistí odpojení RNA polymeráza a ukončení transkripce, tak se jednořetězcová lineární molekula mRNA odpojí a putuje do cytoplazmy k pokračování procesu proteosyntézy - translace

Postranskripční modifikace pre-RNA

Translace Jazyk nukleových kyselin má jen 4 písmena (báze) a jazyk bílkovin 20 písmen (aminokyselin), musí být každá aminokyselina specifikována určitou kombinací bází nukleové kyseliny Kodónem primárně specifikujícím každou aminokyselinu je triplet bází

Transkript mRNA je překládán na ribozómu do primární struktury bílkovin Každá aminokyselina je zařazována na své místo v polypeptidovém řetězci svou tRNA Každá molekula tRNA je schopna navázat pouze jediný typ aminokyseliny – nese specifický antikodón, tj. triplet bází, komplementární ke kodónu mRNA

Každá buňka tedy syntetizuje a má k dispozici tolik různých typů tRNA, kolik kodónů pro jednotlivé aminokyseliny má mRNA, tj 61

Prvním kodónem molekuly mRNA, překládaným při translaci, je vždy tzv Prvním kodónem molekuly mRNA, překládaným při translaci, je vždy tzv. iniciační kodón 5´AUG3´ - tento kodón váže komplementární antikodón 3´UAC5´, který je exponován na tvz. antikodónovém rameni tRNA pro methionin (první aminokyselina každého syntetizovaného polypeptidu)

Druhý kodón pak naváže antikodón tRNA pro druhou aminokyselinu polypeptidového řetězce atd. Takto přiřazená druhá aminokyselina je peptidovou vazbou navázána na první, tj. methionin tRNA pro methionin se tím od něj odpoutá a může na sebe navázat další molekulu methioninu z buněčného roztoku volných molekul Současně je tím umožněno, aby se mRNA po ribozómu posunula o jeden triplet dále, takže tRNA s komplementárním antikodónem se může nyní navázat na její třetí kodón atd.

Na ribozómu se kondenzují molekuly 20 aminokyselin tím, že se postupně vytvářejí peptidové vazby mezi nimi Narůstající polypeptid nabývá postupně také trojrozměrné konformace, jež je určena postranními řetězci těch aminokyselin, které obsahují

Proteosyntéza je velmi složitý a časově i prostorově dokonale spražený soubor specifických molekulárních reakcí a interakcí jednotlivých složek proteosyntetického systému, především ribozómů (s jejich rRNA), mRNA a tRNA.

Ribozómy Místo proteosyntézy v buňce Složité a dynamické supermolekulární struktury Organizují se z RNA a bílkovin na základě rozeznání jedné složky druhou Nejmenší organely všech buněk (E. colli – 15000 ribozómů)

Každý ribozóm je složen z RNA a bílkoviny (většinou ve váhovém poměru 1 : 1) Submikroskopické drobné zrnko, tvořené dvěma podjednotkami, z nichž jedna je větší a druhá menší (obě obsahují rRNA a bílkoviny) Vzájemná vazba vzniká při iniciaci proteosyntézy a zaniká po její terminaci – ribozóm na své podjednotky opět disociuje Úplný ribozóm tedy existuje jen pokud probíhá proteosyntéza

Prokaryotní ribozóm: Eukaryotní ribozóm: mol. hmotnost 2,8x106 sedimentační konstanta 70S (70S ribozóm) větší jednotka – 50S menší jednotka – 30S Eukaryotní ribozóm: mol. hmotnost 5x106 sedimentační konstanta 80S (80S ribozóm) větší jednotka – 60S menší jednotka – 40S

Prokaryotní buňky – rovnoměrně rozptýleny v cytoplazmě Eukaryotní buňky v cytoplazmě (připojeny k cytoskeletu) ne vnějším povrchu membrán endoplazmatického retikula – tvz. drsné (granulární) endoplazmatické retikulum

Táž molekula mRNA se může provlékat současně po povrchu několika ribozómů – jsou spojeny dočasně v polyribozómech (polyzóm) V každém ribozómu pak pak působí mRNA jako matrice, takže polyzóm syntetizuje současně tolik identických proteinových řetězců, kolik je v něm ribozómů Syntéza bílkoviny o mol. hm. 50 000 se příslužná mRNA (o cca 416 kodónech) spojuje asi se 16 ribozómy; syntéza takového polypeptidového řetězce trvá za optimálních podmínek asi 12 sekund

tRNA Funkcí je specificky vázat aminokyseliny, přenášet ji na ribozóm a tam zařazovat na to místo narůstajícího proteinového řetězce, jež jí určuje příslušný kodón v mRNA Molekulová hmotnost je kolem 26 000 Jeden polynukleotidový řetězec (asi 80 ribunokleotidů), jehož 3´-OH konec tvoří sekvence –C-C-A a opačný (5´-P) konec obvykle -G

Na každé molekule tRNA lze rozlišit 4 či 5 dvouřetězových ramen – záklední význam mají dvě ramena: rameno aminokyselinové – tvoří oba konce molekuly: P-5´ i 3´-OH; konec 3´-OH vybíhá do volné sekvence purin-C-C-A, na adenylovou skupinu tohoto ramene se váže příslušná aminokyselina rameno antikodonové exponuje na povrchu molekuly antikodón, tj. trojici nukleotidů, jež je komplementární k určitému kodónu na mRNA