bilirubin klinicko-biochemická diagnostika a metody stanovení Zdravotnická škola, Hradec Králové Stredná zdravotnícka škola, Bánská Bystrica bilirubin klinicko-biochemická diagnostika a metody stanovení

bilirubin (Bi) je lineární tetrapyrolové žlučové barvivo hydrofóbní povahy vzniká při metabolizmu: hemoglobinu (85 %) myoglobinu cytochromů (15 %) jeho syntéza je lokalizovaná v játrech, slezině, v kostní dřeni a v kůži denně se vytvoří asi 300 mg bilirubinu

tvorba bilirubinu hem je oxidován enzymem hemoxygenázou, která je lokalizovaná v hladkém endoplazmatickém retikulu a pro svoji funkci vyžaduje molekulární kyslík a NADPH H2C HC H3C CH2CH2CO2- CH3 CH CH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 N 18 Fe2+ hem oxygenáza NADPH +O2 z hemu tak vzniká zelený lineární tetrapyrol biliverdin a současně se uvolňuje železo O NH NADP+ Fe2+ CO

tvorba bilirubinu biliverdin je dále biliverdin reduktázou NADPH biliverdin je dále biliverdin reduktázou redukovaný na bilirubin biliverdin reduktáza O NH O NH H aby mohl být z těla odstraněný, musí být v hepatocytech přeměněný na rozpustnější derivát

transport a konjugace bilirubinu bilirubin postupuje do krevního oběhu, kde se naváže na albumin jako tzv. nekonjugovaný (nepřímý) bilirubin (je nerozpustný ve vodě) O NH H

transport a konjugace bilirubinu je transportovaný do jater, kde se působením glukuronyltransferázy konjuguje s kyselinou glukuronovou za vzniku konjugovaného (přímého) Bi (je rozpustný ve vodě) 2 molekuly kyseliny glukuronové O NH H HO OH O COO- HO OH O COO- CH2 CO CH2 CO konjungovaný bilirubin je hlavní forma Bi vylučovaná do žluči za fyziologických podmínek

vylučování bilirubinu z těla je Bi vylučován převážně žlučí a v případě zvýšení koncentrace konjugovaného Bi v krvi též močí (jen rozpustná forma bilirubinu) Bi se do žluči dostává z hepatocytů aktivním transportem ze žluči přechází do tenkého střeva, kde se působením střevních reduktáz metabolizuje na urobilinogen 90 % z něho se dále redukuje na sterkobilinogen, který je prekurzorem barviv stolice zbývajících 10 % nepřeměněného urobilinogenu se resorbuje enterohepatálním oběhem do jater, kde se metabolizuje, nebo se znovu vyloučí do žluči

vylučování bilirubinu

hyperbilirubinemie při poruchách metabolizmu Bi se zvyšuje jeho koncentrace v krvi (hyperbilirubinemie), což se projeví žlutým zbarvením kůže, sliznic a očních sklér - tento stav se nazývá žloutenka (ikterus)

hyperbilirubinemie podle převahy konjugovaného nebo nekonjugovaného bilirubinu v séru jsou hyperbilirubinemie: konjugované nekonjugované smíšené podle místa vzniku poruchy v metabolizmu je žloutenka: prehepatální = hemolytická hepatální = hepatocelulární posthepatální = obstrukční

prehepatální ikterus příčiny: nadměrný zánik erytrocytů je způsoben hemolýzou nadměrné odbourávání hemoglobinu jaterní buňky nestačí zpracovávat nekonjugovaný bilirubin příčiny: fyziologický ikterus novorozenců vyvolaný především redukcí počtu erytrocytů v nových podmínkách života po porodu hemolýza při podání inkompatibilní krve autoimunní anemie primární zkratová hyperbilirubinemie (bilirubin vzniká přímo v kostní dřeni následkem defektní erytropoézy)

prehepatální ikterus

novorozenecký ikterus příčiny: nadprodukce Bi defekt transportu Bi v hepatocytech způsobený insuficiencí aktivních transportérů Bi defekt glukuronidace způsobený nedostatečnou aktivitou bilirubin UDP-glukuronyltransferázy absence střevní mikroflóry v novorozeneckém věku terapie: fototerapie + živočišné uhlí + barbituráty výměnná transfuze

hepatální ikterus příčiny: vzniká při vážnějším poškození jaterního parenchymu příčiny: zánětlivé virové onemocnění (původci virové hepatitidy A, B, C, D, E, virus Eppstein-Barrové, cytomegalovirus) toxické působení různých látek a léků v játrech jde o nekrózu jaterních buněk, ztrátu polarity, vnitřní uzávěry žlučových cest, pokles konjugační schopnosti, pokles metabolické degradace urobilinogenu

hepatální ikterus

posthepatální ikterus příčiny: uzávěr žlučových cest (kámen, nádor, striktura), žluč se hromadí před překážkou, zatímco se konjugovaný Bi vrací přes mezibuněčnou tekutinu do krve pokud obstrukce trvá dlouhodobě, poklesne konjugační schopnost jaterních buněk a v krvi se začne hromadit nekonjugovaný bilirubin, čímž vzniká smíšená hyperbilirubinemie s převahou konjugovaného Bi  

posthepatální ikterus

normální až mírně vyšší laboratorní nález bilirubin v séru v moči barva stolice konjugovaný nekonjugovaný urobilinogen bilirubin prehepatální normální zvýšený pozitivní negativní hepatální zvýšený pozitivní hypocholická posthepatální zvýšený normální až mírně vyšší negativní pozitivní acholická

hyperbilirubinemie genetického původu Dubin-Johnsonův syndrom autozomální recesivní onemocnění porucha odevzdávání konjugovaného bilirubinu z jaterní buňky do žlučové kapiláry hodnoty konjugovaného bilirubinu jsou zvýšené (do 170 µmol/l) Rotorův syndrom chronická familiární hyperbilirubinemie podobná jako Dubin-Johnsonův syndrom Gilbertův syndrom autosomální recesivní onemocnění porucha transportu nekonjugovaného Bi ze sinusoidní kapiláry do hepatocytu syndrom je benigní, bez jakéhokoliv poškození funkce jaterních buněk hodnoty Bi jsou menší než 50 µmol/l

hyperbilirubinemie genetického původu Criglerův-Najjarův syndrom vrozený deficit UDP – glukuronyltransferázy (enzym odpovědný za konjugaci Bi s kyselinou glukuronovou) TYP I - autosomální recesivní porucha těžká hyperbilirubinemie s poškozením CNS, které vede ke smrti dítěte do jednoho roku hodnoty Bi jsou vyšší než 350 µmol/l TYP II - autosomální dominantně děděná porucha nedochází k postižení mozku hodnoty Bi jsou do 350 µmol/l

stanovení bilirubinu v séru referenční hodnoty bilirubinu v séru: celkový bilirubin do 17,0 µmol/l konjugovaný bilirubin do 4,3 µmol/l preanalytické podmínky: není nutná speciální dieta ani příprava pacienta vzorek nesmí být vystaven světlu stabilita analytu v séru: 20 – 25 0C 1 den 4 – 8 0C 7 dní - 20 0C 6 měsíců

metody stanovení bilirubinu fotometrické metody metody neenzymové přímá spektrofotometrie oxidační metody azokopulační metody - nejpoužívanější metody (podle Jendrassika a Grófa, metody s DCA a DPD) metody enzymové HPLC s VIS detekcí (vysokotlaká kapalinová chromatografie) metoda je přesná a citlivá, ale náročná na přístrojové vybavení a nevhodná pro rutinní stanovení

fotometrické metody NEENZYMOVÉ přímá spektrofotometrie Bi je oranžovočervený pigment, který absorbuje v pásmu 440-460 nm měření provádíme s korekcí na hemoglobin při 551 nm metoda se používala při stanovení novorozeneckého Bi oxidační metody založené na oxidaci Bi FeCl3 jódem, případně jinými oxidovadly, za vzniku zeleného zabarvení azokopulační metody Bi kopuluje s diazotovanou kyselinou sulfanilovou na roztok azobarviva, který je vhodný pro fotometrické stanovení výsledné zbarvení je závislé na pH

azokopulační metody + + + diazotace – reakce aromatických aminů s dusitany alkalických kovů v prostředí minerální kyseliny a nízkých teplot, za vzniku diazoniových solí NaNO2 + HCl + diazoniová sůl kyselina sulfanilová kopulace – elektrofilní substituční reakce diazoniových solí s aromatickými aminy nebo fenoly, za vzniku azobarviva azobarvivo kyselé pH bilirubin + diazoniová sůl azobarvivo alkalické pH azobarviva – sloučeniny, které obsahují jednu nebo několik azoskupin – N = N - mezi aromatickými zbytky

azokopulační metody reakce podle Jendrassik-Grófa jsou základem v současnosti používaných metod reakce podle Jendrassik-Grófa Bi kopuluje s diazotovanou kyselinou sulfanilovou na roztok azobarviva, které je vhodné na fotometrické stanovení stanovení celkového i přímého Bi probíhá v roztoku akcelerátoru, který uvolňuje nekonjugovaný Bi z vazby na albumin a zabezpečuje jeho rozpustnost ve vodě reakce 2,4-dichloranilinu (DCA) celk.Bi po uvolnění z  vazby na alb. reaguje s diazotovaným DCA reakcí vzniká červený roztok azobarviva, který je vhodný na fotometrické stanovení reakce Bi s 2,5-dichlorfenyldiazoniovou solí (DPD) celkový Bi, po uvolnění z  vazby na albumin, reaguje s DPD

fotometrické metody enzymové (Doumas-Perry) Bi se působením bilirubinoxidázy (BOX) a vzdušného kyslíku oxiduje na biliverdin měří se kineticky pokles absorbance při 424-465 nm přímý Bi se stanovuje při pH 4,5 celkový Bi se stanovuje po přidání akcelerujících detergentů při pH 8,5 metoda je doporučená jako referenční

bilirubin se stanovuje celkový součet konjugovaného a nekonjugovaného celkový bilirubin nekonjugovaný - nepřímý konjugovaný - přímý

bilirubin se stanovuje konjugovaný - přímý konjugovaný konjugovaný bilirubin je rozpustný ve vodě a reaguje přímo s diazočinidlem stanovení celkového bilirubinu probíhá v roztoku akcelerátoru, který uvolňuje nekonjugovaný bilirubin z vazby na albumin a zabezpečuje jeho rozpustnost ve vodě označení „přímý“ a „nepřímý“ Bi se vztahuje k reakčním vlastnostem sérového bilirubinu

stanovení celkového bilirubinu podle Jendrassika a Grófa diagnostický set: Bio-La-Test Bilirubin celkový liquid 350, BIL T L 350 činidla: R 1 činidlo 1 (akcelerátor) benzoan sodný chelaton 3 kofein octan sodný R 2 činidlo 2 kyselina chlorovodíková kyselina sulfanilová R 3 činidlo 3 dusitan sodný pracovní roztoky: činidlo R 1 – určené k přímému použití pracovní činidlo – připraví se smícháním činidla R2 a R3 v poměru 31 + 1

stanovení celkového bilirubinu vlnová délka 546 (540-560) nm, kyveta 1 cm, teplota 15-25 °C. blank vzorku vzorek blank standardu (kalibrátoru) standard (kalibrátor) činidlo R1 0,7 ml vzorek 0,05 ml standard (kalibrátor) 0,05 ml ihned se promíchá a po 5 minutách stání ve tmě se přidá: pracovní činidlo 0,2 ml činidlo R2 0,2 ml promíchá se a po 5 minutách stání ve tmě se změří absorbance blanku vzorku A1, absorbance vzorku A2, absorbance blanku standardu A3 a absorbance standardu A4 proti reagenčnímu blanku zbarvení je za nepřítomnosti světla stálé 30 minut

stanovení přímého bilirubinu podle Jendrassika a Grófa diagnostický set: bilirubin přímý liquid 300, BIL D L 300 činidla: R1 činidlo 1 kyselina chlorovodíková R2 činidlo 2 kyselina sulfanilová R3 činidlo 3 dusitan sodný pracovní roztoky: činidlo R 1 – určené k přímému použití pracovní činidlo – připraví se smícháním činidla R2 a R3 v poměru 26 + 1

stanovení přímého bilirubinu blank vzorku vzorek blank standardu (kalibrátoru) standard (kalibrátor) činidlo R1 1,2 ml vzorek 0,1 ml standard (kalibrátor) 0,1 ml ihned se promíchá a po 5 minutách stání ve tmě se přidá: pracovní činidlo 0,2 ml činidlo R2 0,2 ml promíchá se a po 5 minutách stání ve tmě se změří absorbance blanku vzorku A1, absorbance vzorku A2, absorbance blanku standardu A3 a absorbance standardu A4 proti reagenčnímu blanku zbarvení je za nepřítomnosti světla stálé 30 minut

výpočty linearita (A2 – A1 ) bilirubin (µmol/l) = ––––––––––– x Cst koncentrace standardu (kalibrátoru) linearita metoda je lineární pro stanovení celkového Bi do 500 µmol/l a pro stanovení přímého Bi do 180 µmol/l vzorky s koncentrací celkového Bi nad 500 µmol/l a přímého Bi nad 180 µmol/l se ředí 1 + 1 0,9% roztokem NaCl a výsledek se násobí 2x

výpočty interference stabilita následující analyty neinterferují: - hemoglobin do 10 g/l (pro celkový Bi) a do 5 g/l (pro přímý Bi) - triglyceridy do 40 mmol/l stabilita materiál je třeba chránit před působením slunečních paprsků i umělého světla (na světle klesá zbarvení azobilirubinu asi o 10 % v průběhu 15 minut)

návod k vyluštění tajenky pro 3+1: V každém řádku jsou uvedena 4 slova (tj. 3+1). Před každým slovem je v rámečku uvedeno nějaké písmeno. 3 slova k sobě logicky patří a 1 k nim nepatří a je tudíž odlišné. Písmeno v rámečku, které je u odlišného slova se zapisuje do tajenky, která je v dolní části obrázku. oxidace HPLC Gilbertův syndrom uzávěr žlučových cest hypo- bilirubinémie přímý bilirubin hem S A I T P diazotace polarimetrie Rotorův syndrom acholická stolice žloutenka hem hemoxygenáza T U E D K kopulace enzymové metody Dubin-Johnsonův sy negativní bilirubin v moči ikterus kyselina glukuronová biliverdin V Y C E R T O azobarviva azokopulační metody Downův syndrom konjugovaný bilirubin hyper- bilirubinémie Glukuronyl- transferáza žloutenka B E R A S M I