Syntéza proteinů priony . Molekulární biologie 8. Syntéza proteinů priony . kapitola 13)

Syntéza proteinů mRNA – tRNA – ribosome definition TRANSLACE

tRNA Jetelový list v 2-D zobrazení Tvar písmene L ve 3-D zobrazení místo pro navázání aminokyseliny (CCA konec) akceptorový stonek D smyčka T smyčka variabilní smyčka Vriabilní smyčka – různá délka Acceptor stem – 3’konec končí na CCA Antikodon – modifikovane puriny za ním antikodonová smyčka Jetelový list v 2-D zobrazení Tvar písmene L ve 3-D zobrazení

Struktura tRNA / video http://www.youtube.com/watch?v=4MRCH_J7Fhk

Důležité pro sestavení terciální struktury tRNA a pro vazbu ribozomu tRNA obsahuje báze modifikované až po transkripci RNA D-smyčka = dihydrouracil T-smyčka = TyC = thymin a pseudouracil uracil dihydrouracil uracil pseudouracil a dalsi… Inosine, Důležité pro sestavení terciální struktury tRNA a pro vazbu ribozomu metylace uracil thymin

Báze modifikované v tRNA

Antikodon v tRNA rozeznává kodon v mRNA párování přes vodíkové můstky V realitě nejsou mezeri mezi kodony a pouze 2 tRNA navázány spolu v jeden moment… 1 tRNA = 1 aminokyselina

Genetický kód 64 kodonů 20 aminokyselin Existuje více tRNA pro stejnou aminokyselinu, minimálně 31 rozdílných tRNA v každé buňce Proč jich není 64-3, tedy 61? AUG = methionine (nebo GUG-valin): start kodon UAA, UAG, UGA: stop kodon

Některé tRNA rozeznávají více než jeden kodon 1. nukleotid antikodou a 3. nukleotid kodonu nepárují zcela přesně ‘Wobbling' rules Woble – viklat se, kolisat Inosin – jako adenosin, ale s O2 misto NH2

Univerzální čtecí kód neplatí vždycky výjimky v mitochondriích a některých mikroorganizmech

Nabíjení tRNA aminokyselinou 1. formace aminoacyl AMP 2. přenos na tRNA AK + ATP = aminoacyl AMP + PPi aminoacyl AMP + tRNA = aminoacyl tRNA + AMP AAtS dela oba kroky, do aktivniho mista vaze ATP a AK aminoacyl-AMP aminoacyl-tRNA aminoacyl tRNA syntetázy rozpoznávají antikodon a akceptorový stonek, vážou ATP a AK 1 AK = 1 aminoacyl tRNA syntetáza, tedy 20 různých syntetáz v buňce

Nabíjení tRNA / video http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/translation/addaa.html

RIBOZÓM – komplex RNA a proteinů rRNA S neni uplne primo umerny Mw Historicke duvody, izolace ribozomu… 2/3 RNA, 1/3 proteiny (kolem padesáti) S (Swedberg) – sedimentační koeficient

Velká podjednotka (hlavně 23S) funguje jako peptidyl transferáza = má katalytickou funkci RIBOZYM

Pouze část mRNA se translatuje do proteinu promotor gen 5’UTR ORF 3’UTR mRNA ATG protein Oblasti v 5’UTR a 3’UTR pro regulaci stability mRNA nebo účinnosti translace

Genetický kód lze číst třemi způsoby, podle toho, kde je začátek! Různé čtecí rámce (ORFy) +1 frameshift +2 frameshift Genetická informace v každém čtecím rámci je jiná RŮZNÉ ČTECÍ RÁMCE V RNA STEJNÁ SEKVENCE

…CAAAUGUAUGCAUGCCAAAGGAGGCAUGUAAGGA… Kde najít na mRNA počátek translace? …CAAAUGUAUGCAUGCCAAAGGAGGCAUGUAAGGA… Každá mRNA obsahuje mnoho potenciálních AUG start kodonů První AUG za místem nasednutí ribozomu bude bráno jako počátek translace.

Místo nasednutí ribozomu Shine Dalgarno sekvence na mRNA PROKARYOTA Místo nasednutí ribozomu Shine Dalgarno sekvence na mRNA (aneb ribosome binding site = RBS) ZMINIT NEKDE, ZE U EUKARYOT SE ROZPOZNAVA CEPICKA…, proto nelze polycistronni mRNA anti Shine Dalgarno sekvence na 16S rRNA (malá podjednotka) Přesné párování - vysoká účinnost translace Nepřesné párování – nižší účinnost translace

Iniciátorová tRNA Rozpoznává start kodon: ve většine případů AUG zřídka GUG, ale i zde kóduje Met (not Val) (u proteinů s velice nízkou expresí) váže se rovnou do P-místa ribozomu (ne A) prokaryota – N-formyl-methionin eukaryota - methionin po translaci často odštípnut

Sestavení iniciačního komplexu PROKARYOTA mRNA naváže samostatnou malou podjednotku na SD sekvenci 2. navázání iniciátorové tRNA do AUG 3. navázání iniciačních faktorů 30S iniciační komplex IF2, IF1 – stabilizují fMet-tRNA IF3 – rozpoznává AUG a antikodon v fMet-tRNA a brání také předčasnému navázání velké podjednotky 4. Uvolnění IF3, nasednutí velké podjednotky, uvolnění IF1 a IF2 za spotřeby GTP 70S iniciační komplex

akceptorové místo (A) místo výstupu (E, exit) peptidové místo (P)

3D struktura ribozomu (prokaryotního 70S) Rozhraní mezi malou + velkou podjednotkou tvoří vazebná místa pro mRNA a pro tRNA Ze vazebná místa jsou tvořena oběma podjednotkami, dvě půlky Figure 6-64 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Prokaryotní inciace/ video http://booksite.academicpress.com/Clark/molecular2/anim13_ribosome_assembly_translation_complexes.php

Vždy maximálně 2 tRNA vázány současně na jednom ribozomu Elongace PROKARYOTA Vždy maximálně 2 tRNA vázány současně na jednom ribozomu tRNA přináší novou aminokyselinu, váže se do akceptorového místa za pomoci EF-T 23S rRNA velké podjednotky katalyzuje peptidyl transferázovou reakci – spojení předchozího peptidického řetězce s novou aminkyselinou na tRNA v A místě tRNA s novým peptidem se nakloní směrem k P, díky EF-G (elongation factor G) translokace – mRNA se posune podél ribozomu, tRNA se posune z A do P a z P do E odpadne EF-G, umožní odpadnutí tRNA z E

Terminace PROKARYOTA stop kodon na mRNA: UAA, UAG, UGA neexistuje žádná tRNA, ale jsou rozpoznávány uvolňovacími faktory (RF1 nebo RF2, release factors) peptid je odštěpen peptidyltransferázovou aktivitou ribozomu, tRNA se posune do E místa a odpadne RRF (ribosome recycling factor) uvolní velkou podjednotku uvolnění malé podjednotky a mRNA

Prokaryotní translace / video http://www.biostudio.com/d_%20Protein%20Synthesis%20Prokaryotic.htm http://booksite.academicpress.com/Clark/molecular2/anim13_translation_in_bacteria.php

Prokaryotní mRNA je polycistronní, obsahuje více ORF Shine Dalgarno sekvence Shine Dalgarno sekvence Shine Dalgarno sekvence Každý ORF musí mít svou SD sekvenci, kde nasedne ribozom. Trypanosoma – jediný Eukaryot s polycistronními transkripty

U prokaryot probíhá transkripce a translace současně U eukaryot transkripce v jádře (navíc sestřih), ale translace na ribozomech v endoplazmatickém retikulu nebo v cytoplazmě Bakteriální polyzom není cirkulární.

Ribozomy jdou přímo napojeny na RNA polymerázu přes NusEG komplex

Polyzom (polyribozom) mRNA pokrytá více ribozomy najednou, přibližně 100 bazí od sebe

Polyzom eukaryotní buňky je cirkulární Posunout tento slide pozdeji k eukaryotni translaci? elektronový snímek Poly(A) vazebné proteiny vážou eIF4 na čepičce mRNA

Problém pozastavených ribozomů (stalled ribosomes) PROKARYOTA Problém pozastavených ribozomů (stalled ribosomes) ribozom se uvolní z mRNA pouze pokud se navážou release faktory (RF1 a RF2) mRNA neobsahující STOP kodon budou akumulovat ribozomy tmRNA vypadá trochu jako tRNA (ale bez antikodonu) a trochu jako mRNA jako tRNA váže aminokyselinu (alanin) Nemaji stop kodon protoze ho uzrala ribonukleaza nebo se proste spatne transkriboval, nekompletni transkript bez konce pokud najde pozastavený ribozom, naváže se vedle defektní mRNA a slouží jako templát pro translaci translatuje se 11 aminokyselin a STOP kodon = značka pro degradaci tohoto proteinu (proteasomem) Eukaryota – cirkulární polysom, problem odpadá Místo toho nonsense mediated decay mRNA s predcasnými stop kodony

ROZDÍLY EUKARYOTNÍ TRANSLACE VIDEO: http://booksite.academicpress.com/Clark/molecular2anim13_eukaryote_initiation.php

43S preiniciační komplex Komplex vázající čepičku 43S preiniciační komplex EUKARYOTA 1. Sestavení komplexu vázající čepičku a polyA konec polyA binding protein eIF4E,G,A,B 2. Sestavení preiniciačního komplexu s tRNA a malou podjednotkou ribosomu, za pomoci eIF2 3. Vazba preiniciačního komplexu na komplex vázající čepičku, skenování k prvnímu AUG za spotřeby ATP Pokud AUG příliš vzdálená konsensu GCCRCCAUGG, první AUG nemusí být rozpoznáno Skenování mRNA do prvního AUG VIDEO: http://booksite.academicpress.com/Clark/molecular2anim13_eukaryote_initiation.php Figure 13.29 Assembly of the Eukaryotic Initiation Complex A) The cap-binding complex includes poly(A)-binding protein (PABP), eIF4A, eIF4B, eIF4E, and eIF4G, which is in an unphosphorylated state when unbound to mRNA. ATP transfers phosphates to the complex to make it competent for binding the mRNA. B) The 43S initiation complex forms bringing the small ribosomal subunit together with the tRNAimet. This complex uses GTP to attach the tRNA to the 40S subunit via eIF2. In addition, initiation factors eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5, and eIF2B guide and make the complex competent to bind to the 5’-UTR of mRNA. C) The mRNA is recognized by the cap-binding complex via the connections between eIF4E and PABP which bind the 5’ and 3’ ends of the mRNA, respectively. These two connections cause the rest of the mRNA to loop out. When this is established, then the 43S pre-initiation complex can attach and start scanning for the first AUG. After pausing at the first AUG, then the 50S subunit of the ribosome can bind and initiate translation.

EUKARYOTA 4. odpoutání eIF1,2,3,5 5. nasednutí velké podjednotky 6. počátek elongace (velice podobná prokaryotům)

I R E S (internal ribosome entry site) EUKARYOTA Terminace translace místo dvou uvolňovacích faktorů (RF1 a 2) rozeznává eRF1 všechny tři kodony terminace vyžaduje GTP (hydrolyzovaný pomocí eRF3) uvolnění velké podjednotky pomocí eIF3, uvolnění malé podjednotky a mRNA I R E S (internal ribosome entry site) několik výjimek u eukaryot a virů, kde ribozom nasedá přímo uvnitř mRNA, ne na čepičku

GLOBÁLNÍ REGULACE TRANSLACE PROKARYOTA ribosome modulation factor Dimerizace ribozomů Při obdobích s pomalým růstem buňky jsou přebytečné ribozomy inaktivovány jejich dimerizací pomocí RMF ALCA SLIDY Z PREDNASKY 6 = 52 a dale, regulace translace… 2/3 obsahu buňky jsou proteiny, velmi energeticky náročné, proto regulace proti plýtvání…

Stringent response PROKARYOTA Odpověď bakterií na hladovění, tepelný šok nebo jiný stres vazba nenabité tRNA (kvůli nedostatku aminokyselin) do A místa syntéza pppGpp RelA proteinem vazba ppGpp na polymerázu, změna specificity její vazby na DNA Mycobakterium tuberculosis preziva let uvnitr bunek imunitniho systemu diky strengent respons Zastavení exprese většiny genů Spuštěny geny pro přežití a virulenci

Inaktivace eIF2 EUKARYOTA Při hladovění se sníží většina translace inaktivací iniciačního faktoru eIF2 uvolnění eIF2 po iniciaci, jeho recyklace pomocí eIF2B: iniciace Vysoká syntéza proteinů Forsforylace eIF2 Nízká syntéza proteinů Fosforylace eIF2 brání funkci eIF2B a recyklaci eIF2 = eIF2 není k dispozici pro iniciaci translace Přednáška 6 Další příklady regulace translace, u specifických transkriptů

Selenocystein (Sec) 21. kódovaná aminokyselina vyskytuje se vzácně v proteinech prokaryot i eukaryot tRNA nabitá serinem, ale pak enzymaticky modifikován na selenocystein serin selenocystein

Selenocystein kódován UGA kodonem, který normálně znamená STOP pokud za UGA kodonem následuje SECIS sekvence (selenocystein insertion sequence), přepíše se jako selenocystein a translace pokračuje SECIS sekvence na mRNA tvoří vlásenku

Pyrrolysin (Pyl) 22. kódovaná aminokyselina vyskytuje se vzácně v proteinech u Archea lysin napřed enzymaticky modifikován na pyrrolysin, pak teprve navázán na tRNA kódován UAG kodonem, který normálně znamená STOP

Kolik produktů z jednoho genu? nekódující RNA

Ačkoliv prokaryotní a eukaryotní ribozomy plní stejnou funkci, nemají úplně stejnou strukturu Mnoho antibiotik je založeno na inhibici bakteriální (a pouze bakteriální) translace 30S 50S Figure 6-79 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Inhibitory proteinové syntézy a transkripce Table 6-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Priony Proteiny schopné měnit konformaci jiných proteinových molekul stejného druhu PrP protein původcem několika typů prionového onemocnění mozku savců přirozeně exprimován na povrchu nervových buněk v mozku glykoprotein s cukernými zbytky, upevněn v membráně díky fosfolipidové kotvě přirozená funkce neznámá, možná ochrana před oxidativním stresem neuronů (obsahuje Cu) All known mammalian prion diseases are caused by the so-called prion protein, PrP (Wiki). existuje ve dvou alternativních konformacích: PrPC a PrPSc PrPSc je schopný polymerizovat do fibrilárních agregátu, což je pro buňku toxické (kapitola 21, strana 681)

PrPSc se chová jako infekční protein normální PrPC patologický PrPSc PrPSc se chová jako infekční protein Tvoří dimer s přirozeným PrPC a změní jeho konformaci na PrPSc PRION = infekční agens bez DNA nebo RNA Vznik prionového onemocnění spontánní konformační změna (bez změn na DNA); trvá léta, než se PrPSc akumuluje dědičná mutace s predispozicí ke špatné konformaci tvořeného PrP Creutzfeld-Jacob disease Gertsmann Straussler Scheinker syndrome fatal familiar insomnia přenos mezi jedinci (stejného či jiného druhu) přenosná spongiformní encefalitida (TSE) = syrové maso, sliny, trus Prusiner won the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1997 for his research into prions scrapie – u ovcí a koz nemoc šílených krav (BSE) – obdoba scrapie u dobytka, přenosné na člověka PrPSc PrPSc Priony také u některých hub (kvasinek), ale tam pro buňku prospěšné, adaptace na okolní podmínky

Video z časopisu Nature, výborné…!! http://www.onlinevideolecture.com/medical-science/teabiotech/educational-molecular-biology/index.php?course_id=3942&lecture_no=9