CYTOKINETICKÉ PARAMETRY PROLIFERACE VIABILITA DIFERENCIACE (APOPTÓZA) Změna cytokinetických parametrů odráží efekt použitých modulátorů signálních drah

PROLIFERACE Množení buněk mitózou Dostatek živin, růstových faktorů, pH a teplota prostředí (kultivační techniky) + ovlivnění? Metody stanovení počtu buněk: nespecifické barvení všech proteinů/DNA (metylénová modř, neutrální červeň, tetrazoliové soli MTT, WST1/ CyQuant) Bürkerova komůrka Počítač částic (CASy - Roche )

Viabilita Životnost buněk (vs. mortalita) Živé buňky – semipermeabilní cytoplazmatická membr. Mrtvé buňky – permeabilní cytoplazmatická membr. DYE EXCLUSSION ASSAYS Živá buňka je schopna zabránit průniku barviva dovnitř Barviva: eosin, trypanová modř, propidium iodid, 7 amino actinomycin D, acridin orange, Hoechst 33258 7AAD: SS 1 mg/ml; WS 1 mg/ml … inkubace 1 minutu, hodnocení FACS živé buňky nenabarvené x mrtvé fluoreskují v FL2

Diferenciace Rozrůznění buněk vlivem faktorů okolního prostředí Změna biochemických procesů expresního profilu (mRNA, DNA, proteiny) morfologie povrchových antigenů Detekce těchto změn metodami biochemie molekulární biologie histologie/cytologie imunologie

Buňky HL-60 CD14 CD11b HL-60 HEMATOPOIESIS Committed or Differentiated Stem Cell Maturational Sequence Circulating Pool HEMATOPOIESIS Pronormoblast (proerythroblast) Basophilic Normoblast (erythroblast) Polychromatophilic normoblast Orthochromatic normoblast Reticulocyte Megakaryoblast Promegakaryocyte Megakaryocyte Thrombocyte Monoblast Promonocyte Monocyte Myeloblast Promyelocyte Eosinophilic myelocyte Neutrophilic Eosinophil Band or stab neutrophil metamyelocyte Basophil Lymphoblast Prolymphocyte (Bursa Equivalent) (Thymus) B lymphocyte Plasma cells T lymphocyte Pluripotent Erythrocyte Segmented HL-60 Buňky HL-60 CD14 CD11b

Diferenciační látky – princip účinku Vitamín D3 (VD3, kalcitriol) – aktivace kinázových kaskád, translokace do jádra, aktivace VDR, ovlivnění transkripce Phorbolmyristate acetate/12-O-tetradecanyl phorbol 13-acetate (PMA/TPA) – vazba na receptor asociovaný s protein kinázou C – PI3K – cAMP - pokles cMyc – zástava proliferace Dimetyl sulfoxid 1,3 % (DMSO) – široké spektrum účinků – zvýšení fluidity membrány, aktivace kinázových kaskád, zvýšení Ca2+, vazba na DNA - ovlivnění transkripce, demetylace Souběh drah ovlivňující kinázové kaskády, transkripční faktory (např. PU.1), G/M/GM-CSF

Metody detekce diferencovaných HL-60 buněk Změna enzymového vybavení buněk Nespecifické esterázy Hydrolýza a-naftyl acetátu esterázami vede k vzniku hnědého zbarvení Detekce myeloperoxidázy Myeloperoxidáza štěpí peroxid kyslíku za vzniku kyslíkových radikálů, které pak oxidují o-dianisidin za vzniku barevných látek chinonového charakteru Produkce ROS při oxidativním vzplanutí (monocyty) Redukce NBT (nitroblue tetrazolium) NBT je redukován superoxidem produkovaným monocyty. Redukce vede k změně barvy ze žluté na modrou (změna absorbance) Redukce luminolu superoxidem produkovaným monocyty (změna chemiluminiscence) Změna morfologie - Zvýšená adhese, pseudopodia, zástava proliferace Změna povrchových molekul Exprese CD11b-FITC (R pro C3b složku komplementu) a CD14-PE (vazba LPS) - Detekce protilátkami přímo kongujovanými s fluorescenčními značkami Respiratory burst (is sometimes called oxidative burst) is the rapid release of reactive oxygen species (superoxide radical and hydrogen peroxide) from different types of cells. Usually it denotes the release of these chemicals from immune cells, e.g., neutrophils and macrophages, as they come into contact with different bacteria or fungi. They are also released from the ovum of higher animals after the ovum has been fertilized. These substances can also be released from plant cells. Respiratory burst plays an important role in the immune system. It is a crucial reaction that occurs in phagocytes to degrade internalized particles and bacteria. NADPH oxidase, an enzyme family in the vasculature (particularly in vascular disease), produces superoxide, which spontaneously recombines with other molecules to produce reactive free radicals. The superoxide reacts with NO, resulting in the formation of peroxynitrite, reducing the bioactive NO needed to dilate terminal arterioles, feed arteries and resistance arteries. Superoxide anion, peroxynitrite, and other reactive oxygen species also lead to pathology via peroxidation of proteins and lipids, and via activation of redox sensitive signaling cascades and protein nitrosylation. NADPH oxidase activation has been suggested to depend on prior PKC activation.[1] Myeloperoxidase uses one of these free radicals, hydrogen peroxide, to produce hypochlorous acid. Many vascular stimuli, including all those known to lead to insulin resistance, activate NADPH oxidase via both increased gene expression and complex activation mechanisms.

Imunokomplex Přímá – jednostupňová (silný Ag) Nepřímá – vícestupňová (velká multiplikace signálu) - slabší Ag