Biochemie – regulace metabolismu Josef Trögl

Regulace metabolismu Organismy se vyskytují v proměnlivém prostředí – nutné reakce (adaptace) Snaha udržet ~stálé vnitřní prostředí (homeostáza) Spíše funkčně stálé, než chemicky  udržení životních funkcí rozmnožování, metabolismus, osmotický tlak… ochrana před plýtváním Stres (=zátěž) – pohotová aktivace (mobilizace) obraných a nápravných mechanismů

Regulace metabolismu Různé systémy – v závislosti na evoluční pokročilosti organismus Intracelulární regulace Regulace na úrovni tkání / pletiv Regulace na úrovni orgánů Regulace na úrovni společenstva

Regulace metabolismu Řetěz přenosu informace fyziologická odpověď signál receptor regulace

Signály Chemické – přítomnost / absence /koncentrace látky Fyzikální – změny fyzikálních parametrů Biologické – přítomnost / absence jiných organismů obvykle nepřímo – chemický nebo fyzikální přenos Prostorové …

Receptory Bílkoviny s komplementárním vazebným místem Reakce na signál nekovalentní vazba signálu fyzikální změna po přijetí signálu komplementarita struktur („zámek a klíč“, „ruka a rukavice“) - specifita Reakce na signál často alosterický efekt – „přepnutí struktury“ často spojené s enzymovou aktivitou – zahájení regulačního procesu Lokalizace v cytoplazmě integrálně v membráně na povrchu mnohobuněčných organismů

Regulační mechanismus Často kaskádovitý – zesílení signálu postupný přenos signálu zesílení s každým krokem postupná aktivace – každý člen kaskády aktivuje řádově více dalších členů Na konci změna regulace aktivity enzymu(ů) - aktivace / inhibice regulace exprese genů – produkce enzymů regulace produkce dalších signálních molekul aktivace obranných mechanismů mobilizace zásob… aktivní pohyb

Kinetika vers. termodynamika Každý proces lze popsat z pohledu dynamického – síly, energie kinetického – rychlost Biochemické procesy termodynamický pohled – otázka DG – samovolné vers. nesamovolné procesy kinetický pohled – rychlost biochemických reakcí – aktivita enzymů

Kinetika vers. termodynamika Většina biochemických reakcí probíhá in vivo bez katalýzy zanedbatelnou rychlostí Organismus má k dispozici obvykle dostatek energie Většina metabolitů je v aktivovaném stavu (fosforylované, vázané na CoA…)  DG < 0 Kinetické řízení v biologických systémech převládá

Zpětnovazebná regulace Na všech úrovních regulace - kompenzace výchylky Inhibice biosyntéz metabolickými produkty Termoregulace (oteplení, ochlazení) Změna rychlosti metabolismu dle příjmu živin Aktivní pohyb za živinami / od znečištění …

Intracelulární regulace

Intracelulární regulace Na úrovni buňky Změna aktivity enzymů Změna exprese genu resp. genů

Regulace u mikroorganismů Regulace exprese enzymů Nejekonomičtější = Nejčastější Konstitutivní exprimují se vždy Induktivní exprese je zapínána jako reakce na vnější podnět, např. přítomnost chemické látky Represivní exprese je vypínána jako reakce na vnější podnět Induktivní podléhající represi kombinace předchozích, reakce na dva různé podněty, represe má obvykle přednost

Regulace aktivity enzymů Mnohé enzymy mají proměnlivé prostorové uspořádání  proměnlivou aktivitu alosterické enzymy (=alternativní prostorové uspořádání) Změna struktury vazbou látky mimo aktivní místo enzymu kovalentní modifikací struktury (fosforylace…) odštěpování krátkých peptidů – přeměna na aktivní formu někdy autokatalyticky Inhibice i aktivace

Regulace aktivity enzymů U delších drah regulace jednoho klíčového enzymu obvykle na začátku dráhy Nejčastěji tzv. zpětnovazebná inhibice konečný produkt dráhy inhibuje první enzym A  B  C  D  E  F

Klíčové enzymy základních drah Citrátový cyklus - citrátsyntáza (1. krok), izoctrátdehydrogenáza (3. krok) inhibice ATP, NADH aktivace NAD+, ADP Glykolýza - fosfofruktokináza (3. krok) inhibice ATP, fosfoenolpyruvát, citrát aktivace ADP, AMP

Regulace u živočichů

Regulace na úrovni organismu Různé regulační systémy dle evoluční úrovně organismu u jednobuněčných splývá s intracelulární regulací ALE častá spolupráce v rámci společenstev Zpravidla integrální součást organismu a metabolismu propojuje většinu částí součást dalších orgánů a systémů př.: imunitní systém savců

Endokrinní systém U vyšších savců Produkce a detekce hormónů – přenašeče informace často reakce na změnu koncentrace Žlázy s vnitřní sekrecí – různé umístění a úlohy Propojení s nervovým systémem přímo přes hypothalamus – hierarchie řízení

Hierarchie endokrinního systému Hypothalamus – propojení s nervovým systémem, řídí adenohypofýzu liberiny – aktivují produkci hormónů statiny – zpomalují produkci hormónů Adenohypofýza – řídí další endokrinní žlázy Endokrinní žlázy – řídí metabolismus

Živočišné hormóny Steroidní hormóny – struktura odvozená od steroidů, lipofilní pohlavní hormóny (pohlavní žlázy) – androgeny (samčí), estrogeny (samičí) glukokortikoidy (kůra nadledvinek) – katabolické, ovlivňují např. stres, záněty apod. mineralokortikoidy – řídí vylučování solí ledvinami Hormóny odvozené od aminokyselin – hydrofilní katechnolaminy (dřeň nadledvinek) – adrenalin, noradrenalin – urychlují metabolismus thyreoidní hormóny (štítná žláza) – stimulace metabolismu

Živočišné hormóny peptidové hormóny – hydrofilní glukagon (Langerhansovy ostrůvky pankreatu) – inzulín, glukagon – regulace metabolismu glukózy endorfiny (adenohypofýza) – ovlivňují nervovou soustavu

Mechanismus účinku hormónů Katabolický i anabolický účinek (=aktivace katabolismu resp. anabolismu) Regulace proteosyntézy – př. steroidy, h. štítné žlázy Regulace aktivity enzymů – alosterické změny, přeměny do aktivních forem – př. katecholaminy Změna propustnosti membrán – urychlení látkové výměny – př. inzulin …

Receptory hormónů Lipofilní hormóny (např. steroidy) – intracelulární receptory samovolně přecházejí přes membránu bílkoviny s aktivním místem pro vazbu hormónu vliv na metabolismus obvykle regulace transkripce Hydrofilní hormóny (např. peptidy) – membránové receptory samovolně neprocházejí membránu do buňky se předává jen informace receptor obvykle spřažen s enzymem vznik druhých poslů (second messanger) – látky zajišťující přenos informace v buňce

Receptory hormónů cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) – univerzální druhý přenašeč vznik z ATP za katalýzy adenylátcyklázy ATP  cAMP + PPi zánik za katalýzy fosfodiesterázy cAMP  AMP G-proteiny – trimerní membránové váží a štěpí GTP na GDP po vazbě hormónu aktivují adenylátcyklázu do doby štěpení GTP – zesílení signálu

Receptory hormónů

Receptory hormónů

Vztah MO ke kyslíku

Endokrinní disrupce Nežádoucí interakce cizích látek s endokrinním systémem - endokrinní disruptory Chemikálie – PCB, bisfenol A … nepatřičné hormóny – estrogeny (antikoncepce) ve vodě blokování vazby standardního hormónu nežádoucí stimulace blokování přenosu (krví apod.)

Fytohormóny – ovlivňují různé funkce rostlin Regulace u rostlin Fytohormóny – ovlivňují různé funkce rostlin padání listí růst zrání … Zajímavé v zemědělství Různé struktury – auxiny, gibereliny, citokininy, kyselina abscisová Některé fytohormóny mají i účinek na vyšší organismy rostlinné fytoestrogeny – analoga ženských hormónů

Regulace u mikroorganismů

Konstitutivní enzymy Konstituce = ustanovení Syntéza bez ohledu na vnější podmínky Enzymy základních metabolických drah (glykolýza, citrátový cyklus…)

Induktivní enzymy Indukce = vyvolání Aktivita je zapínána popř. zesilována v přítomnosti určitého faktoru (induktoru) chemické látky, záření… Např. katabolické dráhy pro rozklad neobvyklých substrátů není substrát = enzymy jsou zbytečné Př.: fotoreparace je indukována světlem

Zejména anabolické syntetické dráhy Represivní enzymy Represe = potlačení Aktivita je vypínána popř. zeslabována v přítomnosti určitého faktoru (represor) chemické látky, záření… Zejména anabolické syntetické dráhy substrát je k dispozici z prostředí = není ho třeba syntetizovat

Induktivní enzymy podléhající represi Enzym je syntetizován jen v přítomnosti induktoru a zároveň absenci represoru Umožňuje buňce postupné využívání substrátu od nejjednoduššího po nejsložitější př. laktózový operon je indukován laktózou, ale reprimován glukózou

Induktivní enzymy podléhající represi Přítomný substrát: Laktóza  bakterie konzumuje laktózu Glukóza  bakterie konzumuje glukózu Laktóza i glukóza  bakterie konzumuje glukózu

Regulace odbouráváním enzymů Méně častá Málo prozkoumaná V exponenciální mikrobiální kultuře obvykle malá obměna („údržba“) Větší rozklad při přechodu do jiného fyziologického stavu Sporulace Jiný substrát Přechod do jiné růstové fáze … = v enzymech je vázáno mnoho aminokyselin

Vztah MO ke kyslíku Aerobní – vyžadují kyslík Anaerobní – nevyžadují kyslík Mikroaerofilní – potřebují jen málo kyslíku (urychluje růst) Aerotolerantní – nepotřebují kyslík, ale nevadí jim Obligátní = povinné, nemohou žít v jiném prostředí Fakultativní = volitelné, mohou žít i v jiných prostředích

Obligátní Obligátní aerobové Obligátní anaerobové nemohou žít bez kyslíku, hynou např. plísně Penicillium Obligátní anaerobové kyslík je zabijí např. bakterie Clostridium

Fakultativní Umí přepínat metabolismus mezi aerobním a anaerobním respirace ↔ kvašení přepínání mezi aerobní a anaerobní respirací (místo kyslíku např. dusičnany) Aerobní respirace je nejúčinnější pro získávání energie  v přítomnosti kyslíku většina MO přepíná na respiraci

Regulace metabolismu MO Metabolismus MO funguje velmi úsporně Regulační mechanismy umožňují rychlou adaptaci metabolismu při změně podmínek Regulace na různých úrovních inhibice a aktivace enzymů syntéza enzymů (exprese genů) – transkripce, translace odbourávání enzymů

Pasteurův efekt Pozorován poprvé Louisem Pasteurem Kvasinky v přítomnosti kyslíku rostou rychleji a zpomalují kvašení Vysvětlení: aerobní metabolismus glukózy uvolňuje 19x více energie než anaerobní Praktické aplikace alkoholové kvašení je prováděno za anaerobních podmínek produkce kvasnic je prováděna za aerobních podmínek

Kyslíkový efekt Zobecnění Pasteurova efektu na jiné organismy (bakterie) na jiné metabolické dráhy = Kyslík reprimuje metabolické dráhy, které jsou v jeho přítomnosti zbytečné nebo nežádoucí fermentace respirace jiných substrátů (dusičnanů…) Kyslík indukuje dráhy, kterou jsou k jeho využití potřebné citrátový cyklus dýchací řetězec … Regulace obvykle na úrovni transkripce málo prozkoumané

Crabtreeho efekt Pozorován poprvé angličanem Herbertem Crabtreem Opak Pasteurova efektu Při vysokých koncentracích glukózy fermentují kvasinky i v přítomnosti kyslíku Dosud spolehlivě nevysvětleno – hypotézy plýtvání – fermentace je biochemicky jednodušší (méně enzymů), při velkém nadbytku nevadí nižší výtěžnost energie konkurenční – vzniklý ethanol inhibuje konkurenční mikroorganismy Pravděpodobná souvislost s katabolickou represí

Glukózový efekt = represe mnohých metabolických drah glukózou (u různých MO) využívání jiných zdrojů uhlíku transportní bílkoviny pro přenos těchto substrátů do buňky citrátový cyklus dýchací řetězec dělení mitochondrií u kvasinek fotosyntéza sporulace tvorba bičíků produkce toxinů …

Glukózový efekt Mnohé nejasnosti Glukóza je nejrychleji využitelný substrát obvykle konstitutivní enzymy pro buňku je jednodušší využít glukózu než jiné substráty Represe dýchání má význam pravděpodobně v jednodušším metabolismu či ochraně proti kyslíku Nejasný smysl represe toxinů či bičíků Klíčová role glukózy je pravděpodobně dána evolucí

Glukózový vers. kyslíkový efekt Glukózový a kyslíkový efekt působí opačně co kyslík indukuje, to glukóza reprimuje a opačně V reálném prostředí jsou oba procesy v rovnováze v závislosti na vnějších podmínkách „ladění metabolismu“

Katabolická represe Zobecnění glukózového efektu na další snadno využitelné substráty represe využití dalších substrátů hierarchie využívání („horší“ a „lepší“ substráty, glukóza „nejlepší“) Represe probíhá už při transportu látky do buňky zastavení transportu „horšího“ substrátu represe syntézy bílkovin pro využití horšího substrátu

Katabolická represe Význam katabolické represe = udržování rovnováhy mezi katabolismem a anabolismem katabolismus musí produkovat tolik ATP a NADPH kolik anabolismus potřebuje ani méně ani více Analogie s elektrárnami

Katabolická represe Mechanismus není zcela znám Regulační úloha cyklického AMP (cAMP) cAMP je potřeba pro indukci mnohých genů lépe využitelný substrát reprimuje tvorbu cAMP při transportu do buňky univerzální působení i u vyšších organismů

Souhrn efektů Pasteurův – indukce dýchání, represe fermentace kyslíkem Crabtree – indukce fermentace, represe dýchání glukózou Kyslíkový – indukce dýchání, represe alternativních způsobů získání energie kyslíkem Glukózový – represe využití „horších“ substrátů glukózou, represe fyziologických procesů Katabolická represe – represe využití „horších“ substrátů lepšími

Souhrn efektů Efekt Efektor Indukce Represe Pasteurův Kyslík Dýchání Fermentace Crabtree Glukóza Kyslíkový Aerobní metabolismus Anaerobní metabolismus Glukózový Využití „horších“ substrátů Fyziologické procesy Katabolická represe Snadněji využitelné substráty

Operon = soubor genů se společnou regulací a expresí Operony U bakterií a archeí Geny pro enzymy jedné metabolické dráhy jsou v DNA uloženy za sebou Společná regulace Společná transkripce do jedné mRNA Společná exprese Operon = soubor genů se společnou regulací a expresí

Pozitivní a negativní regulace Regulační mechanismus na molekulární úrovni transkripce může být dvojího typu: negativní – bránění transkripce pozitivní – zvyšování pravděpodobnosti iniciace transkripce Regulační bílkoviny !!! negativní a pozitivní mechanismus souvisí jen s ději na úrovni transkripce, indukce i represe mohou být pozitivní i negativní!!!

Regulační bílkoviny Bílkoviny se schopností vazby na DNA, RNA polymerázu, ribozómy apod. Vazba induktoru resp. represoru změna prostorového uspořádání (konformace) změna funkce fyziologická odpověď

Negativní indukce DNA

Bez induktoru – transkripce neprobíhá Negativní indukce Bez induktoru – transkripce neprobíhá regulační bílkovina brání transkripci Regulační bílkovina

Bez induktoru – transkripce neprobíhá Negativní indukce Bez induktoru – transkripce neprobíhá regulační bílkovina brání transkripci RNA polymeráza Regulační bílkovina

Bez induktoru – transkripce neprobíhá Negativní indukce Bez induktoru – transkripce neprobíhá regulační bílkovina brání transkripci RNA polymeráza Regulační bílkovina

S induktorem – transkripce probíhá Negativní indukce S induktorem – transkripce probíhá RNA polymeráza Regulační bílkovina

S induktorem – transkripce probíhá Negativní indukce S induktorem – transkripce probíhá RNA polymeráza Regulační bílkovina

S induktorem – transkripce probíhá Negativní indukce S induktorem – transkripce probíhá RNA polymeráza Regulační bílkovina

S induktorem – transkripce probíhá Negativní indukce S induktorem – transkripce probíhá RNA polymeráza

S induktorem – transkripce probíhá Negativní indukce S induktorem – transkripce probíhá RNA polymeráza

Pozitivní indukce

Bez induktoru – iniciace transkripce probíhá s malou frekvencí Pozitivní indukce Bez induktoru – iniciace transkripce probíhá s malou frekvencí Slabý promotor RNA polymeráza

S induktorem – iniciace transkripce probíhá s vysokou frekvencí Pozitivní indukce S induktorem – iniciace transkripce probíhá s vysokou frekvencí Regulační bílkovina pomáhá iniciaci transkripce Regulační bílkovina

S induktorem – iniciace transkripce probíhá s vysokou frekvencí Pozitivní indukce S induktorem – iniciace transkripce probíhá s vysokou frekvencí Regulační bílkovina pomáhá iniciaci transkripce Regulační bílkovina

S induktorem – iniciace transkripce probíhá s vysokou frekvencí Pozitivní indukce S induktorem – iniciace transkripce probíhá s vysokou frekvencí Regulační bílkovina pomáhá iniciaci transkripce Regulační bílkovina

S induktorem – iniciace transkripce probíhá s vysokou frekvencí Pozitivní indukce S induktorem – iniciace transkripce probíhá s vysokou frekvencí Regulační bílkovina pomáhá iniciaci transkripce RNA polymeráza Regulační bílkovina

Negativní a pozitivní indukce Negativní – dva stavy exprese probíhá / neprobíhá Pozitivní – různá intenzita exprese genů exprese vysoká / nízká

Nah a sal operony Pseudomonas Metabolismus naftalenu horní dráha: naftalen  salicylová kyselina spodní dráha: salicylová kyselina  CO2+H2O Každá dráha je kódována samostatným operonem horní dráha: nah operon spodní dráha: sal operon Pozitivní indukce salicylovou kyselinou

Regulace v rámci společenstev Viz ekologie, sociologie U mikroorganismů běžná mezibuněčná komunikace fyziologické změny celé kultury – přechod do stacionární fáze, tvorba biofilmů…

Quorum sensing Quorum = kvóta, množství =Fyziologická odpověď bakterie na koncentraci buněk Poměrně rozšířená tvorba biofilmů luminiscenční mikroorganismy …

Princip quorum sensing Vypouštění a detekce nízkomolekulárních signálních látek, např. homoserinlaktonů Málo buněk  nízká koncentrace signálních látek  žádná odpověď Hodně buněk  vysoká koncentrace signálních látek  fyziologická odpověď