Oxid dusnatý (.N=O) vaclav.hampl@lf2.cuni.cz

http://fyziologie.lf2.cuni.cz

Proč přednáška o NO? 1985: znečištění vzduchu (smog, kyselý déšť) dnes: nejstudovanější endogenní molekula dekády

Explozivní rozvoj znalostí o NO Učebnice to špatně stíhají

Proč ještě je NO zajímavé? Účastní se funkce všech hlavních orgánových systémů Během pár let od základního objevu k fundamentálním pokrokům klinické praxe

Z historie: 1620 První příprava NO: Jan Baptista van Helmont Cu + HNO3 -> Cu2+ + NO + H2O (t.j. dříve než třeba kyslík - 1774)

1772 Chemická charakterizace: Joseph Priestley (objevitel kyslíku)

1800 Toxicita: Sir Humphry Davy (málem umřel, když se toho nadýchal)

1867 Amylnitrit snižuje krevní tlak při hypertenzi (dnes víme, že to dělá tím, že uvolňuje NO)

(dnes víme, že to dělá tím, že uvolňuje NO) 1914-1918 Plnění nitroglycerinu do granátů -> nízký krevní tlak Proto nitroglycerinové tablety proti angině pectoris (dnes víme, že to dělá tím, že uvolňuje NO)

1977 NO aktivuje guanylát cyklázu a tak zvyšuje intracelulární koncentraci cGMP: Ferid Murad

1980 Endoteliální relaxační faktor (EDRF): Robert Furchgott

Louis Ignarro, Salvador Moncada 1987 Eukaryotické buňky umí tvořit NO: Louis Ignarro, Salvador Moncada

1998 Nobelova cena za fysiologii a lékařství “Za klíčové objevy týkající se NO jako signální molekuly v kardiovaskulárním systému"

Chemie NO NO je plyn NO je radikál (kapalní při -152oC, tuhne při -164oC) NO je radikál tj. lichý počet valenčních elektronů má jich 11 (N2 má 10; O2 má 12) Z N2 a O2 vzniká jen za zvláštních podmínek (např. blesk) Taky spalovací motory, elektrárny

Rozpustnost NO Málo rozpustný ve vodě ~1.7 mmol/l při 25oC t.j. podobně jako O2 či N2 Lipofilita -> snadný průchod membránami

Autooxidace NO V přítomnosti O2: NO2 je jedovatý radikál 2 NO + O2 --> 2 NO2 NO2 je jedovatý radikál Rychlá (několik sec), je-li NO i O2 hodně Pomalá, je-li NO málo to je většinou v tkáních (NO < 10 M)

Autooxidace NO ~ 200x rychlejší v roztoku než v plynné fázi V roztoku jsou produktem autooxidace nitrity (NO2-) Pouze v přítomnosti hemoproteinů proběhne oxidace až na nitráty (NO3-)

Reakce se superoxidem O2- je reaktivní kyslíkový radikál vzniká trochu v respiračním řetězci hodně v místech zánětu (NADPH oxidáza) S NO tvoří extrémně rychle peroxynitrit: NO + O2- --> OONO- OONO- není radikál, ale je vysoce reaktivní (víc než O2-) a cytotoxický (taky nitrosyluje) a v biol. systémech déle vydrží

Inaktivace NO hemoglobinem Velká afinita NO k hemu Rychlá inaktivace NO oxidací s Fe oxyhemoglobinu za vzniku NO3- nitrosoHb --> metHb --> Hb reduktáza --> oxyHb

L-arg + O2 --> NO + L-cit Biosyntéza NO Pětielektronová oxidace terminálního guanidino dusíku L-argininu molekulárním kyslíkem: L-arg + O2 --> NO + L-cit Stereospecificita Celou reakci katalyzuje jediný enzym, NO syntáza (NOS)

NO syntázy 3 izoformy: I, II, III obsahují v aktivním centru hem aktivní jako homodimery nutné kofaktory: NADPH 6(R)-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin FAD FMN kalmodulin obr.: bovine eNOS

Ca2+ Aktivita NOS Ca2+ BH4 - NH2 FMN FAD Hem - COOH NH2 - FAD COOH - CAM CAM BH4

Ca2+ Aktivita NOS Dimerizace NO NO L-Arginin + O2 N-OH-L-Arg L-Citrulin NO NADPH NADP+ + H+ e - NH2 - FAD COOH - FMN Hem BH4 - NH2 - COOH CAM NADPH NADP+ + H+ e - N-OH-L-Arg L-Arginin + O2 L-Citrulin NO Dimerizace

NOS I nNOS (neuronální) ~160 kDa Gen na lidském chromosomu 12 Vyžaduje Ca2+ (nutné pro vazbu kalmodulinu) Rozpuštěná v cytosolu

NOS I Konstitutivně exprimována: Regulace aktivity: centrální a periferní neurony některý epitel, cévní hladký sval kosterní sval Regulace aktivity: Ca2+ ser/tyr fosforylace NO (zpětnovazební inhibice)

NOS I Hlavní uplatnění: neurotransmise neuromodulace

NOS II iNOS (inducibilní) ~130 kDa Gen na lidském chromosomu 17 Nepotřebuje Ca2+ (váže kalmodulin trvale i bez Ca2+) Rozpuštěná v cytosolu

NOS II Exprese je inducibilní (cytokiny...): Regulace aktivity: makrofágy glie, hepatocyty endotel, epitel srdeční myocyty, hladký sval,… Regulace aktivity: indukce exprese NO (zpětnovazební inhibice)

NOS II Hlavní uplatnění: boj s infekcí zabíjení nádorových buněk

NOS III eNOS (endoteliální) ~133 kDa Gen na lidském chromosomu 7 Vyžaduje Ca2+ (nutné pro vazbu kalmodulinu) Vázaná na buněčnou membránu (kaveoly)

NOS III Konstitutivně exprimována: Regulace aktivity: endotel plicní a renální epitel; trombocyty srdeční myocyty hipokampus Regulace aktivity: Ca2+ ser/tyr fosforylace modulace exprese

NOS III Hlavní uplatnění: regulace cévního tonu regulace krevního zásobení orgánů

Mitochondriální NOS Podobná NOS I Nejasný význam

Účinky NO na cílovou tkáň 1. Cytotoxicita: při vysoké koncentraci (iNOS) poškození bílkovin, DNA, lipidů oxidace (O2, O2-) —> reaktivní, toxické produkty (NO2, ONOO-) inhibice respirace boj s infekcí a tumory

Účinky NO na cílovou tkáň 2. Prostřednictvím cGMP: Při nižších koncentracích (eNOS, nNOS) Oxidace jen pomalá Převládá vazba NO na hem solubilní isoformy guanylátcyklázy  cyklický guanosin-3',5‘ monofosfát (cGMP) cGMP aktivuje cGMP-dependentní protein kinázu (G-kinázu)

solubilní isoforma (typ I) Mechismus NO-cGMP

Fosfodiesterázy cyklických nukleotidů Další osud cGMP Inaktivace cGMP: Fosfodiesterázy cyklických nukleotidů zejména typ V. vzniká 5'-GMP

Farmakologie NO Donory NO Inhibitory NOS Aktivátory eNOS (nitroglycerin, nitroprusid, NOáty) Inhibitory NOS (L-NMMA, L-NAME, aminoguadinin, ADMA) Aktivátory eNOS (endotel-dependentní vazodilatancia) Inhibitory fosfodiesterázy (Sildenafil, Zaprinast)

Funkce NO: Neurotransmise Difusní modulace NANC Retrográdní messenger (zpětné potvrzení příjmu zprávy) Dlouhodobá potenciace (presynaptická buňka příště vyšle silnější signál - podklad paměti) Učení, paměť, spánek, bolest, deprese

Funkce NO: Cytotoxicita Boj s infekcí a tumory: baktérie (i jinak obtížně zlikvidovatelné, např. Mycobacterium tuberculosis) houby parasiti tumory inhibice replikace virů

NO v dechu Nejvíc NOS je v nose a paranasálních dutinách Dezinfekce ? Regulace plicních cév ? Mění se při některých nemocech (astma) NO v dechu (ppm)

Vazodilatace závislá na endotelu s endotelem + L-NAME bez endotelu s endotelem

Vazodilatace závislá na endotelu Acetylcholin Cholinesteráza M1 M3 Endotel NO Hladký sval Relaxace

Vazodilatace závislá na endotelu Acetylcholin M1 M3 Endotel Acetylcholin NO Hladký sval M3 Kontrakce Relaxace

Vazodilatace závislá na endotelu Potencují ji: estrogeny ženy před menopauzou  riziko kardiovaskulárních chorob po menopauze doženou muže insulin  nabídka glukózy tkáním díky  prokrvení

Funkce NO: regulace cév Průtokem indukovaná vazodilatace: vazodilatace v periferních orgánech ->  rychlost proudu krve v proximálnějších cévách ->  střižné napětí (shear stress) ->  aktivita (a exprese) eNOS -> vazodilatace proximálnějších cév NO je v tomto nenahraditelný (porucha vede k hypertenzi)

„Tonická“ tvorba NO Střední arteriální tlak (mmHg)

Endogenní inhibitory NOS Asymetrický dimethylarginin (ADMA) NG-monomethyl-L-arginin (L-NMMA)  ADMA ->  riziko atherosklerózy

Průtok krve plícemi při narození

NO a termoregulace Pot: Mills et al, JAP 1997

NO v ledvinách Zprostředkuje tlakovou diurézu:  arteriální tlak -> mechanické namáhání endotelu ->  syntéza NO -> difuse k proximálním tubulům ->  reabsorbce Na+

NO a erekce NO z terminál n. pelvici relaxuje kavernózní hladký sval

NO u samic El. stimulace GRAGASIN et al The neurovascular mechanism of clitoral erection: nitric oxide and cGMP-stimulated activation of BKCa channels FASEB J, Sep 2004; 18: 1382 - 1391.

Funkce NO Snižuje srážlivost krve Inhibice adhese, agregace a sekrece trombocytů Aktivované trombocyty také tvoří NO - zpětnovazební inhibice agregace Fylogeneticky staré - krabi před 500 milióny let (hodně dlouho před savci)

NO inhibuje apoptózu Apoptóza: "fysiologický" způsob smrti Na rozdíl od nekrózy nepůsobí zánět NO (->cGMP -> G kináza) inhibuje apoptotické fosforylační signály NO přímo inhibuje kaspázy (specifické proteázy apoptózy)

Další funkce NO NO z endokardu moduluje srdeční kontraktilitu Tlumí kontrakci kosterního svalu Esenciální negativní regulátor proliferace při vývoji (bez zastavení růstu není diferenciace) Kost: Hodně NO (např. estrogenem, namáháním - NOS I): inhibice resorpce (inhibicí tvorby a aktivity osteoklastů) Málo NO: potenciace resorpce indukované cytokiny asi esenciální pro normální funkci osteoklastů Podíl na regulaci laktace (?) block NO -> rust se nezastavuje, zádná diferenciace

Patofysiologie NO septický šok hypertenze (?) atheroskleróza angina pectoris záněty erektilní dysfunkce diabetes mellitus (?) mozková mrtvice, roztroušená skleróza, Alzheimer (?), Parkinson (?)

Septický šok Infekce (endotoxin) indukuje expresi iNOS Vysoká tvorba NO: likvidace infekce ale i vazodilatace -> masivní hypotenze

NO a hypertenze  eNOS -> hypertenze Ale: syntéza NO nebývá při hypertenzi  (někdy je )

NO a hypertenze NO v mozku výrazně moduluje sympatickou aktivitu lokální inhibice NOS v mozku ->  systémový tlak krve

NO a hypertenze:  Dysfunkce NO není prvotní příčinou hypertenze Poškození endotelu vysokým tlakem ovšem může sekundárně narušit tvorbu NO To pak hypertenzi dále zhoršuje

NO při hypercholesterolémii Lidské koronární arterioly in vitro

NO a atheroskleróza Atherosklerotický plát -> endoteliální dysfunkce ->  tvorba NO -> paradoxní vazokonstrikce (např. koronární cévy při námaze - angina pectoris) ->  ochrana proti tvorbě trombů -> např. až infarkt

Patologie CNS (např. mrtvice, roztroušená sklerosa,...) zánětlivá aktivace glie indukce iNOS NO inhibuje respiraci neuronů uvolnění glutamátu excitotoxická smrt

NO v terapii Inhalace plynného NO: PPHN ARDS Šok - pokusná terapie inhibitory NOS (aminoguanidin) (výsledky zatím nejednoznačné) Erektilní dysfunkce - Viagra (inhibitor PDE V.)

Inhalace NO při ARDS

Inhalace NO při PPHN

Viagra (sildenafil) Pacienti se zlepšením erekce (%) Příčina dysfunkce: Pacienti se zlepšením erekce (%)