Replikace DNA DNA replikace Replikace chromozómu u bakterií Replikace lineárních chromozómů u eukaryot Replikace plasmidů

DNA replikace Veškeré buňky musí duplikovat svou DNA předtím než se rozdělí

Složení DNA A - T G - C vodíkové můstky v komplementárních bazích (2x u AT, 3x u GC) vodíkové můstky spolu s hydrofobními interakcemi heterocyklů bazí nad sebou (stacking) stabilizují dvoušroubovici

Složení DNA DNA řetězec fosfodiesterová kostra Do prednsaky o transkripci dat otazku, PROC synteza ve smeru 5-3 a ne 3-5 Na 5’ konci vždy volná fosfátová skupina, na 3’ konci volná hydroxylová skupina. DNA je čtena při transkripci, i replikaci vždy ve směru 5’ 3’. Pořadí bazí v DNA se vždy zapisuje od 5’ konce ke 3’ konci !

Struktura DNA DNA šroubovice antisense vlákno sense vlákno fosfodiesterová kostra DNA šroubovice báze malý žlábek velký žlábek RNA = jenoretezcova nebo vlasenky atd. Pravotociva = pri pohledu se shora do osy se vlakna staci po smeru hodinovych rucicek DNA se skládá ze dvou antiparalelních řetězců tvořící většinou pravotočivou šroubovici. Báze jsou uvnitř, fosfo-diesterová kostra zvnějšku.

Meselson-Stahl pokus 1958 „ the most beautiful experiment in biology“ 3 teorie, jak je DNA replikována Semi-konzervativní Konzervativní Disperzní

Meselson-Stahl pokus 1958 „ the most beautiful experiment in biology“ 3 teorie, jak je DNA replikována Semi-konzervativní Konzervativní Disperzní

Meselson-Stahl pokus Tím, že je lehký řetězec detekován, nemůže být tato teorier pravdivá Těžký řetězec není detekován, Tato teorie není pravdivá

Replikace DNA DNA musí být rozdělena na 2 vlákna Každé vlákno je replikováno (původní vlákno slouží jako templát) – replikace je semikonzervativní Watson-Crick párování (A s T, G s C)

Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace Replikon Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace Chromozómy - kruhové Chromozómy - lineární Plasmidy – prokaryotické (kruhové a lineární) Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek) Genomy mitochondrií a chloroplastů Genomy virů, viroids

Obecný mechanismus replikace Původní vlákno slouží jako templát V 60. letech – pozorování replikující se DNA, tvoří písmeno Y – REPLIKAČNÍ VIDLIČKA Replikační multienzymatický komplex obsahující DNA polymerázu

Obecný mechanismus replikace DNA polymeráza (DNAP) byla objevena v roce 1957 A. Kornbergem (E.coli) Vždy ve směru 5‘  3‘ 1960 – radioaktivní thymidine, na pár sekund, existence krátkých úseků DNA Okazakiho fragmenty 1000 – 2000bp u prokaryot 200 bp u eukaryot Replikace je asymetrická Vedoucí (leading) vlákno je replikováno kontinuálně Opožďující se (lagging) vlákno je replikováno diskontinuálně

Obecný mechanismus replikace Replikace vždy ve směru 5´  3´ Reakce je hnaná uvolněnou energií z dNTP, PPi se rozpadá na jednotlivé molekuly fosfátu

Obecný mechanismus replikace Replikace vždy ve směru 5´  3´ Reakce je hnaná uvolněnou energií z dNTP, PPi se rozpadá na jednotlivé molekuly fosfátu  human DNA polymerase beta 

Obecný mechanismus replikace Replikace vždy ve směru 5´  3´ Reakce je hnaná uvolněnou energií z dNTP, PPi se rozpadá na jednotlivé molekuly fosfátu

Obecný mechanismus replikace Korekturní aktivita – proofreading activity DNA polymeráza dělá chybu každých 106 bází Mutace ale detekovány pouze na každých 109 - 1010bazí – jak to? 3´  5´ exonukleázová aktivita Nachází se na jiné podjednotce, či doméně DNAP Tato aktivita odštípne veškeré nukleotidy, které nejsou dobře spárované Tato aktivita vyžaduje perfketně spárovaný začátek

Korekturní aktivita je důvod proč polymerizace probíhá pouze ve směru 5‘ ku 3‘.

Obecný mechanismus replikace DNA polymeráza potřebuje RNA primer Pro vedoucí vlákno je nutný pouze 1 primer Pro opožďující vlákno jsou nutné primery kdykoliv DNAP dokončí Okazakiho fragment (během pár sekund) DNA primáza – RNA polymeráza Používá NTP, u eukaryot jsou 10 bazí dlouhé DNAP polymerizuje dokud nenarazí na další RNA primer Proč RNA primer a ne DNA primer ? Mutace 10nt/200bp  5% genomu Rozpoznání RNA/DNA dvouvlákna

Obecný mechanismus replikace RNA primery jsou nakonec odstraněný exonukleázovou aktivitou DNAP I a nahrazeny dNTPs DNA polymeráza I – reparační (RNase H) rozeznávající DNA/RNA segmenty DNA ligáza vytvoří kovalentní vazbu mezi dvěma sousedními nukleotidy

Komplex replikační vidličky Proteiny, které se účastní replikace Helikáza ATP dependentní, 1000bp/s Single-strand binding protein (SSBP) Stabilizují ssDNA, prevence krátkých vlásenkových struktur DNA polymeráza III Ráda se odpojuje od DNA Komplex pohybující se svorky (sliding clamp) Váže DNAP Nezabraňuje rychlému pohybu DNAP Jakmile narazí na dsDNA, DNAP se odpojuje DNA gyráza

Komplex replikační vidličky https://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0 https://www.youtube.com/watch?v=4jtmOZaIvS0

Topologické problémy při replikaci DNA DNA/ chromozóm se nachází v negativní (pravotočivé) dvoušroubovici Rozpletení dvoušrobovice (800b/s) pomocí helikázy Oba řetezce je nutno oddělit a prootočit Chromozom nemůže jen tak rotovat (musel by se otočit kolem vlastní osy 50x/minutu) Vzniklé napětí je uvolněno topoisomerázami (I a II) DNA gyráza (typ II) - zavádí negativní superspiralizace a tím uvolňuje pozitivní (levotočivou) superspiralizaci způsobenou helikázou

Replikace kruhové DNA Baktérie, E. coli genom je 4.6 106bp 2 replikační vidličky (-replikace) DNA replikace a buněčné dělení je synchronizováno Genom je schopen se přepsat během 40 minut

Iniciace replikace kruhovité molekuly Iniciace replikace v ori (oriC) Iniciační komplex obsahuje 5 proteinů: DnaA (initiator proteins), DnaB (helikáza), DnaG (primase), DNA gyrázu, SSB oriC obsahuje repetice 3x GATCTNTTNTTTT a 4x TTATNCANA Vazba DnaA proteinu Na rozvolněnou DNA se naváže DnaB a DnaC (helicase loading protein)– začátek replikační vidličky Helikáza aktivuje primázu a tím pádem syntézu RNA primeru

Terminace replikace kruhové molekuly Ukončení replikace – Ter místa Replikace probíha v obou směrech (po směru a proti směru hodinových ručiček) TerC, TerB, TerF TerA, TerD, Ter E Vážou Tus proteiny Jejich delece jsou slučitelné se životek, replikační vidlička je nepotřebuje k ukončení replikace Separace spojených molekul toposiomerázou IV (typ topoisomerázy II)

Replikační proteiny v E.coli FUNKCE DnaA Váže se na počátek replikace (ori) Helicase (DnaB) Uvolňuje dsDNA DnaC Pomáha helikáze při vazbě na DNA SSBP Udržuje ssDNA Primáza (DnaG) Syntéza RNA primerů RNáza H Odstranění RNA primerů DNA polymeráza I Vyplňuje mezery mezi Okazakiho fragmenty DNA polymeráza II Reparační enzym DNA polymeráza III Hlavní replikační enzym (,,) Sliding clamp (,,,, ‘,,) DNA ligáza Liguje niky, zvlášte pak v lagging vláknu DNA gyráza  a  podjednotka, zavádí negativní otáčky Topoisomeráza IV Štípe a liguje dsDNA, uvolňuje negativní otáčky

Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace Replikony Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace Chromozómy - kruhové (bakteriální) Chromozómy - lineární (eukaryotické) Plasmidy – prokaryotické (kruhové a lineární) Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek) Genomy mitochondrií a chloroplastů Genomy virů, viroids

Replikace DNA u eukaryot Stejný princip jak u baktérií Podrobný princip znán díky práci na S. cerevisiae Replikační systém vyizolovaný ze savčí buňky – 80. léta Komplikovanější MCM – minichromosome maintenance DNAP  , ,  DNAP  - primase – iniciace replikace, syntetizuje primer, který pak prodlužuje pomocí dNTPs – 20nt – iDNA RPA – replication protein A – chrání ssDNA, 3 podjenotky RFC – replication factor C – váže se na iDNA, přibírá do komplexu posuvnou svorku (PCNA protein) + 2 DNAP DNAP  - přepisuje opožďující se vlákno DNAP  - přepisuje vedoucí vlákno PCNA - Proliferating cell nuclear antigen, homotrimer Regulační proteiny– Cdc45, GINS complex – neznámá funkce Primery jsou odstraněny pomocí exonukleázy Fen1 a/nebo Dna2 (rozdíl oproti baktériím) Mezery jsou dosyntetizovány DNAP  a spojeny pomocí DNA ligázy

Iniciace, počátek replikace u eukaryot Lidský genom 3.3x109 bazí, 1 průměrný chromozóm 1.5x108 bp Rychlost replikace pouze 50bp/sec, trvalo by to 33 dní Mnoho počátků replikace U kvasinek cca každých 30 000 bazí, cca 400 počátků replikace U lidských somatických buněk - 10 000 až 100 000 počátků replikace Obousměrná Replikační bublina Synchronizace každý chromozóm je replikován pouze jednou každý počátek prochází iniciací pouze jednou

Iniciace, počátek replikace u eukaryot Nejlépe studován u kvasinek ORC komplex (origin recognition complex) se váže na na počátek replikace a spouští řadu reakcí: Cdc6, Cdt1 a ORC a MCM (helicase) = pre-replicative complex (pre-RC) Tento komplex se formuje pouze v G1 fázi Pre-RC je aktivován kinázou S-Cdk odpojují se Cdc6 a Cdt1 tím se aktivuje helikáza Spouští se replikace

Nukleosomy Chromatin remodelling proteins – destabilizují vazbu histonů na DNA Chromatin assembly proteins – histony, jenž pomáhají zabalit DNA zpět do nukleosomů - Histone modifikace, epigenetika, dědičnost

Telomery Problém při replikaci lineárních chromozómů DNA polymeráza potřebuje primer Po odstranění RNA primeru dojde ke zkrácení DNA Telomery OPAKOVANÉ KRÁTKÉ SEKVENCE OBVYKLE 6 BÁZÍ TTAGGG – OBRATLOVCI TELOMERASE – PRODLOUŽÍ KONCE DNA O JEDEN TANDEM PROTEKCE PROTI EXONUKLEAZOVÉ AKTIVITĚ EXTRÉMNĚ KONZERVOVANÉ Buněčné hodiny

Replikace lineárních chromozómů - vyjímky Protein primery DNA polymeráza může použít volnou –OH skupinu aminokyseliny z proteinu, který se váže na konec chromozómu Tento protein také chrání DNA před degradací Systém používán některými viry a bakterií rodu Streptomyces (lineární chromozóm) Vlásenková struktura chrání konce DNA u Borrelia

Replikon Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace Chromozómy - kruhové (bakteriální) Chromozómy - lineární (eukaryotické) Plasmidy – prokaryotické (kruhové a lineární) Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek) Genomy mitochondrií a chloroplastů Genomy virů, viroids

Plasmidy Kruhové molekuly DNA samostatně se množící Vyjímky jsou lineární plasmidy a RNA plasmidy (zjednodušené RNA viry) Parazitují na buněčném aparátu pro svou replikaci Přinášejí buňce určitou selekční výhodu Nemohou být bez buňky Vyskytují se v různém počtu (obvykle 1-2 plasmidy/chromozóm, ale až 50) Velikost plasmidu je velmi různá Plasmidy mohou nést gen zajišťující resistenci na antibiotikum Kryptické plasmidy (bez očividné funkce) F-plasmidy – specifické pro E.coli R-plasmidy – objeveny díky baktériím rodu Shigella a Salmonela P-plasmidy – promiskuitní

Obousměrná replikace Replikace valivou kružnicí

Stejný mechanismus replikace ukazuje na příbuzný vztah mezi plasmidy a viry ssDNA viry dsDNA viry

Mechanismus replikace plasmidu F - conjugation F - fertility Nízké copy number, 100kb Konjugativní vlastnosti Tra+ transfer positive plasmidy tra geny (nejméně 30 genů) F+ (donor) and F- (recipient) Některé malé plasmidy jsou tra-, ale mob+ (mohou být mobilizovány za přítomnosti Tra+ plasmidu) Bakteriální sex Obousměrná replikace (ori V) Konjugační most Replikace valivou kružnicí (ori T)

Plasmidy s resistencí na antibiotika R plasmidy 1-2 kopie na buňku Objeveny během 50.let v Japonsku Bacteria Shigella resistentní vůči sulfonamidům, penicilinu, tetracyklinu, chloraphenicolu atd. R plasmidy jsou transferu schopné Resistentní kmeny baktérií jsou velmi problematické Zákaz používaní lidských antibiotik na prevenci nákazy u zvířat Použití v genovém inženýrství Transformace bakterií – bakterie může si vzít do své buňky DNA ze svého okolí

Resistance vůči -laktam antibiotikům Nejrozšířenější skupina antibiotik (penicilín, ampicilín, cephalosporin) Působí na buněčnou stěnu baktérií Reaguje s enzymem budující buněčnou stěnu, nedochází ke cross linku peptidoglycanu a dochází k disintegraci buněčné stěny Obsahují -laktam kruh Resistence díky enzymu -laktamázy (bla gen) Modifikace antibiotické struktury – více odolná na štěpení -laktamázou Administrace antibiotika + analogu laktamu (clavulanic acid), který se váže na enzym a inhibuje ho Otevírá -laktamový kruh

Resistence to chloramphenicol Chloramphenicol, streptomycin a kanamycin Působí na bakteriální translaci (vážou se na 23S rRNA) Resistence: Chromozomální mutace ribosomálních proteinů – nedojde k inhibici pomocí antibiotika, ale sníží se efektivnost translace Plasmidová – chloramphenicol acetyl transferáza (CAT) Substituce za fluorine – resistentní vůči modifikaci Acetyl skupiny

Resistence na aminoglykosidy Streptomycin, kanamycin, neomycin Produkované půdními baktériemi rodu Streptomyces (sami si produkují resistenci-indukující enzym) Obvykle 3 cukerné kruhy, z nichž alespoň jeden nese aminokyselinu Vážou se na SSU ribozómu a inhibují translaci Inaktivace jejich aktivit pomocí modifikací (fosforylace, acetylace, adenylace) Resistence: neomycin phosphotransferase (npt gen) Derivát kanamycinu – Amikacin – jeho acetylace schopný cukerný zbytek je blokován hydroxybutyratovou skupinu – i přes to již došlo k evoluci nové N-acetyl transferázy, která je schopna acetylovat tuto molekulu

Resistence vůči tetracyklinu Tetracyklin se váže na 16S rRNA a inhibuje translaci Inhibuje prokaryotickou i eukaryotickou translaci (eukaryota ho aktivně neimportují, spíše naopak, efektivně ho exportují) Resistence: Plasmid R kódující transporter, který umožnuje efektivní export tetracycklinu zpět do prostředí

Závislost buňky na plasmidu Buňka přežije pouze v případě, že si udrží plasmid 2 komponenty produkované plasmidem: toxin (více stabilní) and protijed (méně stabilní) Protein-based operon F-plasmidu: CcdA (protijed) a Ccd B (toxin, inhibuje DNA gyrázu) RNA-based system: protijed je antisense RNA, která neumožňuje translaci toxinu (Host-killing protein – Hok and Sok antisense RNA)

Ti plasmidy Tumor-inducing (Ti) Přenos mezi baktérií a rostlinou Ti plasmid se nachází v baktérii Agrobacterium Část plasmidu je přenesena do rostlinné buňky pomocí procesu připomínající konjugaci Dojde k začlenění (náhodnému) do chromozómu a k expresi růstových hormonů – nádor a místo pro množení baktérie Ti oblast plasmidu obsahuje geny pro auxin (zvětšuje objem buňky), cytokin (indukuje replikaci buňky) a opin (zdroj energie pro baktérii) Použití v genovém inženýrství Arabidopsis thalianna – 27 000 genů přerušeno pomocí Ti plasmidu – inaktivace genu – studium fenotypu

Replikon Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace Chromozómy - kruhové Chromozómy - lineární Plasmidy – prokaryotické Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek) Genomy mitochondrií a chloroplastů Genomy virů, viroids

2 plasmid kvasinek Kruhová molekula 6318bp (dsDNA) 50-100 kopií/haploidní genom Sobecká DNA, nepřináší buňce žádnou výhodu Nachází se v jádře!, váže histony a formuje nukleozóm Replikace pouze 1x za buněčný cyklus, jak si udrží počet kopií 50 – 100? Skladba: 2 obrácené repetice (rozdělují plasmid na 2774 a 2346bp) Flp rekombináza (flipáza) katalyzuje rekombinace, rozeznáva Frt místo Přepne na replikaci pomocí valivé kružnice Použítí v genovém inženýrství – eukaryotický klonovací vektor

Polymerázová řetězcová reakce - PCR Umožňuje namnožení DNA z velmi malého množství Kary Mullis – Nobelova cena v roce 1993

Polymerázová řetězcová reakce - PCR

Polymerázová řetězcová reakce - PCR

Reverzní transkripce (RT-)PCR Složitá manipulace s geny obsahující exony mRNA již obsahuje sekvenci, která je translatovatelná Pomocí reverzní transkriptázy (enzym z retrovirů) vytvoření DNA z mRNA Vytvoření jednoho vlákna cDNA – templátová DNA Studium exprese genů

Real time qPCR

Řízená mutageneze Umožňuje změnu sekvence Substitute, delece či inzerce aminokyselin Původní plasmidová DNA izolovaná z baktérií je methylována Nová pomocí PCR vytvořená plasmidová DNA není methylována Restrikce za použití enzymu, který štípe pouze methylovanou sekvenci Transformace pouze nově vytvořeného plasmidu