Ribozymy mirka.rovenska@lfmotol.cuni.cz

Ribozym: RNA s katalytickou aktivitou Zvyšuje rychlost a specifitu štěpení fosfodiesterové vazby syntézy peptidové vazby Přirozený výskyt: od virů po člověka

Za objev, že RNA se v buňkách nejen podílí na přenosu dědičných vlastností, ale vystupuje též jako biokatalyzátor, byla r.1989 udělena Nobelova cena za chemii S. Altmanovi (USA) a T.Cechovi (USA) S. Altman T. Cech

Přirozeně se vyskytující ribozymy

Ribozym x (proteinový) enzym Strukturní rysy spoluurčují možné katalytické mechanismy (ovlivňují potenciální kontakty, terciární strukturu…): RNA je vystavěna jen ze 4 různých bází, zatímco proteiny obsahují 20 různých aminokyselin ( malý repertoár funkčních skupin u RNA) vysoká hustota záporného náboje lokalizace bází do vnitřku duplexů (vzniklých párováním bází) u RNA x v α-helixu proteinů směřují postranní řetězce AA ven Přesto jsou způsoby katalýzy u RNA velmi rozmanité a využívají: ionty kovu acidobazickou katalýzu, např. pomocí bází NA nízkomolekulární metabolity jako kofaktory asistence substrátu (např. tRNA) Obvykle jde o určitou kombinaci několika z těchto způsobů

Ribozym & (proteinový) enzym Způsoby katalýzy se obecně zdají podobné: RNA, stejně jako proteinový enzym, využívá kyselé/zásadité skupiny resp. ionty kovů k aktivaci nukleofilního činidla a stabilizaci náboje odstupující skupiny Pro funkci ribozymu je rovněž nezbytné vytvoření určité sekundární a terciární struktury RNA (párováním bází komplementárních úseků RNA řetězce); stejně tak je důležitá určitá primární struktura určitých úseků Některé ribozymy mohou rychlost reakce zvýšit až 103-1011-krát (ribozym HDV štěpí fosfodiesterovou vazbu stejně rychle jako proteinový enzym RNasa)

Metaloribozymy a) Ribonukleasa P RNasa P katalyzuje místně specifickou hydrolýzu prekurzorové tRNA, kterou se tvoří funkční tRNA V bakteriích i eukaryotech (včetně člověka) Katalytická aktivita závisí na přítomnosti dvoumocných iontů kovu (Mg2+, Mn2+) Velký ribozym, obsahuje RNA i protein(y), ale vlastním katalyzátorem je RNA

Metaloribozymy b) Self-splicing introns Velké introny (> 200 nukleotidů), které jsou schopny se samy vyštěpit z primárního transkriptu U bakterií i eukaryot (např. v pre-RNA prvoka Tetrahymena, v primárních transkriptech mitochondriálních genů kvasinek a rostlin…)

Splicing Introny = nekódující segmenty RNA, které jsou roztroušeny mezi oblastmi budoucí zralé mRNA kódujícími protein (exony) Před translací musí být introny odstraněny a exony se musí spojit ve funkční mRNA Genomická DNA exon 1 exon 3 oblast promotoru intron 1 exon 2 intron 2 intron 3 transkripce 1 2 3 splicing Pre-mRNA (hnRNA) Funkční mRNA

Self-splicing x splicing Některé introny se mohou z primárního transkriptu vyštěpit samy, bez jinak obvyklé účasti spliceosomu (komplex RNA a proteinů / enzymů – např. helikasa) Self-splicing proběhne in vitro i bez účasti proteinů, ovšem in vivo často probíhá za přítomnosti určitých proteinů, které zvyšují jeho efektivitu (např. stabilizují potřebnou strukturu RNA) Self-splicing introns na rozdíl od proteinových enzymů zprostředkovávají jen jedno kolo úpravy

Self-splicing introns: Introny skupiny I: self-splicing je zahájen nukleofilním atakem 3´-OH exogenního guanosinu (navázaného v konkrétním místě vodíkovými vazbami) na fosfodiesterovou vazbu Introny skupiny II: atakujícím nukleofilem je 2´-OH konkrétního adenosinu, který je součástí intronu Ionty kovů (Mg2+, Mn2+) by mohly: podporovat tvorbu správné struktury aktivního místa orientovat substrát aktivovat nukleofil deprotonací 2´-OH guanosinu stabilizovat záporný náboj

Introny skupiny I: atak exogenního guanosinu 3´-OH exogenního guanosinu atakuje fosfodiesterovou vazbu v 5´-místě sestřihu; tato vazba se štěpí a GMP se připojuje na 5´-konec intronu… 1. transesterifikace Uvolněný 3´-konec exonu pak napadá esterovou vazbu v 3´-místě sestřihu; intron se uvolní a oba exony se spojí … 2. transesterifikace (viz další obr.)

Introny skupiny I Introny skupiny II vnitřní A napadá vazebné místo pro guanosin vnitřní adenosin exon 1 exon 2 vnitřní A napadá fosfodiesterovou vazbu v 5´-místě sestřihu G napadá fosfodiesterovou vazbu v 5´-místě sestřihu štěpení mezi 3‘ koncem exonu 1 a 5‘-koncem intronu koncová 3‘OH exonu 1 napadá a štěpí fosfodiesterovou vazbu v 3‘-místě sestřihu exony jsou spojeny, intron se uvolní p…fosfát

Jak je důležité mít správnou strukturu: místo rozpoznávané guanosinem (místo 1. ataku) 5´-místo sestřihu spárované báze Správná primární, sekundární a terciární struktura je důležitá pro: rozpoznání vazebného místa pro guanosin rozpoznání míst štěpení vazebné místo pro guanosin 3´-místo sestřihu vlásenka se smyčkou

Vlásenka páteř báze uvnitř

Introny skupiny I jako skutečné enzymy Self-splicing introns na rozdíl od proteinových enzymů zprostředkovávají jen jedno kolo úpravy (své vyštěpení) ALE: když je intron skupiny I už vyštěpen, může fungovat jako skutečný enzym: opakovaně rozpoznávat komplementární sekvenci jiné molekuly RNA (pomocí tzv. internal guide sequence, IGS), napadat ji 3´-OH skupinou navázaného guanosinu a katalyzovat její štěpení

ribozym napadající substrátovou RNA RNA (substrát) (intron skupiny I po vyštěpení) ribozym napadající substrátovou RNA

Potenciální terapeutické využití intronů skupiny I Můžeme (in vitro) požadovaným způsobem změnit IGS, a tak vytvořit ribozymy, které štěpí, tj. ničí, cílovou molekulu RNA…testováno jako možná nová terapeutická metoda V současné době je testován syntetický ribozym, který likviduje mRNA pro receptor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). VEGF stimuluje angiogenezi, takže zablokování jeho působení by mohlo připravit vyvíjející se nádor o potřebné krevní zásobení.

2. Malé ribozymy viroidů a satelitů Hammerhead Hairpin Ribozym HDV (hepatitis delta virus) Satelity: malé RNA viry nebo RNA molekuly, jejichž pomnožení je závislé na hostitelské buňce a na koinfekci tzv. pomocným virem Ribozym je součástí větší RNA (viroidu nebo satelitu), která je repliko-vána hostitelskými RNA-polymerasami Produkt této replikace se štěpí účinkem ribozymové aktivity na jednotlivé molekuly satelitní RNA

Podobné reakcím katalyzovaným proteinovými enzymy RNasami cyklický fosfát Nukleofilní atak 2´-OH na sousední 3´-fosfát  vzniká 2´-3´ cyklický fosfát Jde o acidobazickou katalýzu: 2´-OH je aktivován pro nukleofilní atak odejmutím protonu zásadou (B). Jiný proton je kyselinou (A) poskytnut pro stabilizaci záporného náboje vznikajícího na odstupujícím kyslíku O5´. Podobné reakcím katalyzovaným proteinovými enzymy RNasami U HDV: cytosin (=NH+–) vystupuje jako kyselina a protonuje odstupující skupinu; ion kovu aktivuje nukleofil

Hammerhead

Ribozymy hammerhead a hairpin se nacházejí v satelitních RNA resp Ribozymy hammerhead a hairpin se nacházejí v satelitních RNA resp. viroidech infikujících rostliny X HDV je lidský patogen: koinfekce HDV s HBV (pomocný virus) je vážnější a komplikovanější než infekce samotným HBV

3. Riboswitches Elementy bakteriální mRNA, které kontrolují genovou expresi pomocí vazby malých molekul (koenzymů, aminokyselin, bází nukleových kyselin) Ribozym GlmS: lokalizován v 5´-UTR mRNA pro glukosamin-6-fosfát (GlcN6P) synthetasu; v přítomnosti GlcN6P (produktu enzymu) se vyštěpí  down-regulace produkce synthetasy (a tedy i GlcN6P)  riboswitches mohly u primitivních organismů fungovat jako metabolické sensory

Mechanismy reakcí katalyzovaných pomocí riboswitches A) „konformační“ – vazba metabolitu navodí konformační změnu v RNA, která ovlivní terminaci transkripce nebo iniciaci translace B) „chemické“ – u GlmS: aminoskupina GlcN6P může fungovat jako kyselina a aktivovat odstupující skupinu  štěpení (oranžové vazby):

4. Ribosom je ribozym Peptidyltransferasa = ribozym translace

Peptidyltransferasová aktivita může být zvýšena jistým proteinem (L27), přesto ale lze tuto aktivitu (i když nižší) pozorovat i v jeho nepřítomnosti Ačkoli tento protein usnadňuje tvorbu peptidové vazby, není pro ni nezbytný

Jak RNA katalyzuje tvorbu peptidové vazby? Hypotézy: Párování bází mezi CCA na konci tRNA v P a A místech a 23S rRNA napomáhá správné orientaci -aminoskupiny aminoacyl-tRNA pro reakci s karbonylem rostoucího polypeptidu Přenos protonu z aminoskupiny aminoacyl-tRNA přes 2´-OH adenosinu (z koncového CCA tripletu tRNA v P-místě) na jeho O3´ za přenesení peptidylu (-CO-R) na aminoacyl-tRNA: V tomto navrženém mechanismu je tedy pro katalýzu esenciální tRNA!!! O3´

Hypotéza o „světě RNA“ Hypotéza: RNA původně sloužila jako genetický materiál i jako katalyzátor; až postupně katalytickou funkci mnoha molekul RNA převzaly proteiny Kationtové jíly (montmorillonit) mohou řídit oligomerizaci jednotek podob-ných monomerům dnešní RNA a tvorbu „RNA“, a to s jistou sekvenční selektivitou  na počátku života stála RNA, až později se objevily DNA a proteiny Jako kofaktory užívají ribozymy např.: vit. B12, FMN, glukosamin-6-fosfát, S-adenosylmethionin ad. Některé z těchto kofaktorů jsou využívány i proteinovými enzymy pro oxidace, redukce, tvorbu C-C vazeb  Byly toho schopny i molekuly RNA? A přetrvaly některé z nich až dodnes?

Proč pak máme proteinové enzymy? Aktivní místo intronů skupiny I je ekvivalentní k (proteinovým enzymům) DNA a RNA polymerasám (stejná organizace iontů kovu)  jaký selekční tlak vedl k současnému proteinovému systému pro replikaci a transkripci (náhradě ribozymů proteinovými enzymy)? Důvodem je pravděpodobně větší přesnost, procesivita a rychlost reakcí v proteinových systémech