Vyšetřování parametrů buněčné imunity kvantitativní - počty buněk (subpopulace leukocytů) kvalitativní (funkční testy) - testy fagocytózy - testy aktivace bb.

Průtoková cytometrie (FC) standardní metoda analýzy buněk v suspenzi - nejčastěji tzv. polychromatická imunofenotypizace krevních leukocytů, bb. kostní dřeně, popř. analýza bb. v moči, likvoru, výpotcích, bronchoalveolární laváži atd. základní dělení buněk při vyšetření FC dle jejich fyzikálních vlastností - velikosti (FSC, forward scatter, rozptyl v přímém směru), granularity (SSC, side scatter, rozptyl pod úhlem 90 st.) dle fluorescence – vybrané CD znaky bb. jsou značeny monoklonálními Abb konjugovanými s fluorochromy (př. phycoerytrin /PE – červený, fluoresceinizothiokyanát /FITC – zelený)

Zdroj obr.: Ing. Petra Šandová, Klinická imunologie a alergologie – laboratoř ÚKBLD a 1. LF UK VFN

Průtoková cytometrie (FC) vzorek - většinou plná heparinizovaná krev (popř. krev nabíraná do EDTA); BAL, sputum, laváže, výpotky, liquor.. využívá metodu tzv. přímé imunofluorescence: před vyš. v FC přidáme ke vzorku množství monoklonální protilátky (mAb) konjugované s fluorochromem mAb vyrobena tak, aby specificky reagovala s určitým antigenem př. CD molekulou b.→ vazba mAb s CD molekulou → buňka je přímo označena fluorochromem (= přímá imunofluorescence) umožňuje současnou detekci několika antigenů na jedné buňce (různé mAb označí různé znaky) - př. T lymfo (CD3+), B lymfo (CD19+), Th (CD3+CD4+), Tc (CD3+CD8+), NK (CD3-CD16+ a/nebo CD56+)

Průtoková cytometrie (FC) vzorek se vloží do cytometru → nasaje suspenzi → jednotlivé bb. prochází (jsou usměrněny) tenkou kapilárou jedna za druhou konstatntní rychlostí (= hydrodynamická fokusace) Zdroj obr.: Ing. Petra Šandová, Klinická imunologie a alergologie – laboratoř ÚKBLD a 1. LF UK VFN

Průtoková cytometrie (FC) laserový paprsek dopadá na kapiláru, resp. na jednotlivé bb. procházející kapilárou – měření počtu bb. a rozptylu světla (FSC, SSC) → rozdělení bb. dle granularity a velikosti na základní populace (lymfocyty, monocyty, granulocyty), graficky znázorněny v tzv. histogramu, viz obr. neutro SSC lymfo mono FSC

Průtoková cytometrie (FC) fluorochrom na mAb po ozáření laserem emituje světlo určité vlnové délky → cytometr detekuje tyto fluorescence a rozděluje je systémem optických hranolů, filtrů a zrcadel podle vlnové délky (tzn. rozděluje fluorescencím odpovídají subpopulce) → převedeny na elektrické impulsy → počítačové zpracování, grafické znázornění v tzv. dot plotu, viz obr. komentář k obr.: mAb konjugovaná s fluorochromem PE, specificky navázaná na znak CD3, označuje populaci všech T lymfocytů (CD3+); mAb konjugovaná s FITC, specificky navázaná na CD4, označuje jen Th lymfo (CD3+CD4+) CD4-FITC CD3-PE

Průtoková cytometrie (FC) – příklady využití kvantitativní testy: vyšetření subpopulací lymfocytů, NK, aktivovaných T lymfocytů; poměru CD4/CD8 (dg. AIDS), onkoproteiny (dg. malignit), atd. b) kvalitativní testy - funkční: vyšetření fagocytózy (ingesce, oxidativní vzplanutí) testy aktivace (př. T-lymfocytů, bazofilů)

Průtoková cytometrie (FC) – příklady využití Test aktivace bazofilů: založen na expresi aktivačního znaku (př. CD63) na povrchu periferních bazofilů po jejich expozici alergenem in vitro; následná detekce aktivačního znaku průtokovou cytometrií; pomocné vyš. v diagnostice atopie Princip zjednodušeně: heparinizovaná krev pacienta alergického na daný alergen + stimulační pufr (IL-3) + alergen dojde k přemostění sousedních FceRI s navázanými sIgE na povrchu bazofilů alergenem = aktivace bazofilů → exprese aktivační povrchové molekuly CD63 na povrchu bazofilů dodání značené protilátky proti znaku CD63 (anti-CD63-FITC) → detekce aktivačního znaku CD63 průtokovou cytometrií

Test aktivace bazofilů anti-CD63-FITC CD 63 FcεRI (receptor pro IgE) IgE Alergen