C7900 Lehká biotechnologie 10 – Organická rozpouštědla Petr Zbořil

Osnova prezentace Produkce organických rozpouštědel a dalších látek pro chemický a farmaceutický průmysl. Butanol a aceton - ABE, 2,3-butandiol - BDL, glycerol. Některé řazeny k výrobám biopaliv, zde je hlavním etanol (není součástí sylabu).

Butanol-aceton Produkce butanolu a acetonu (+ etanol) ABE Historie 1911 objev ABE kvašení – Fernbach 1916 vypracován fermentační postup – Chaim Weizmann Surovinou škrob

Butanol-aceton Užití Aceton pro výrobu výbušnin – WWI Butanol pro letecký petrolej a syntetický kaučuk– WWII Konkurence petrochemie Nově butanol jako biopalivo, lepší než etanol – renesance biobutanolu

ABE Metabolický základ produkce Bakterie rodu Clostridium – anaerobní Hlavní a vedlejší dráhy Tok materiálu podle druhu mikroorganizmu, kvantitativní rozdíly Zúčastněné enzymy – přenos genů Bakterie rodu Clostridium – anaerobní C. butylicum, C. acetobutylicum aj. – dle substrátu apod. Heterofermentativní – BuOH, aceton, HAc, EtOH, butyrát, 2-propanol Další produkty – CO2, H2 Mutace a selekce, genové manipulace

ABE Hlavní cesty – obdoba ketogeneze Další produkty, meziprodukty Hexosy (pentosy) – CH3COCH2CO~SCoA CH3CH(OH)CH2CO~SCoA – CH3CH2=CH2CO~SCoA CH3CH2CH2CO~SCoA – CH3CH2CH2CHO – CH3CH2CH2CH2OH HMG~SCoA – CH3COCH2COOH – CH3COCH3 (CH3CH(OH)CH3 u C. butylicum) Další produkty, meziprodukty Fermentace prochází různými stadii, mění se složení, převládají typické produkty (kyseliny octová a máselná, plyny)

ABE Metabolické cesty produkce

ABE Metabolické cesty produkce

ABE Fáze produkce, chybí plyny

ABE Suroviny Typy produkce Mnoho přírodních využitelných substrátů Škrob – Weizmannův typ Sacharosa – sacharotyp Další – testované Mnoho přírodních využitelných substrátů Topinambury, jablečná dřeň, syrovátka … Hemicelulosy

ABE Suroviny – možné substráty

ABE Suroviny Škrobnaté materiály – brambory, kukuřice, obilí Vhodné pro C. acetobutylicum, má amylasu Úprava strouháním, drcením, sterilizace Většinou soběstačné co do ostatních nutričních faktorů Melasa, sulfitové výluhy Jiná Clostridia Nutná úprava a dodatkové živiny

ABE Úprava surovin Melasa Obtížněji se fermentuje, obsahuje inhibitory, chybí některé nutriční faktory Vhodná kombinace s obilnou surovinou (ca 10% hlavního tanku, nejlépe formou zákvasu), jinak přídavek výpalků Nutno přidávat NH4+ a bílkoviny (autolyzát kvasinek, kukuřičný výluh) Vhodné je předem invertovat sacharózu (4% H2SO4), úprava na pH 6,5-6,4

ABE Úprava surovin Sulfitové výluhy Obsahují toxické látky (SO2, fural aj.), nutno odstranit propařením, srážením Ca(OH)2 apod. Chudé na důležité nutriční faktory Doplňují se zdrojem N, P a K, vhodná je kombinace s obilným zákvasem, klíčky apod.

ABE Fermentační postupy Úprava surovin, „upstream“ Vlastní fermentace Podle typu, vybavení – drtič, pařák, síta, sterilizace Vlastní fermentace Periodická Bateriová Kontinuální – není zcela vyřešena Izolace, „downstream“ Extrakce Destilace

ABE Periodická fermentace Propagace Ca 5 L baňky 1 – 2 m3 předkvasná část 200 – 1000 m3 produkční fermentory Vybavení Potrubí a ventily spojovací, přepouštěcí mezi tanky, odvod plynů, pojistný ventil, přívod media, zákvasu, sterilních plynů, očkovací tubus, vzorkovací kohout Termostat, chlazení, míchadlo, tlakoměr

ABE 2 stadia (4 fáze) periodické fermentace Acidogeneze a solventogeneze Fáze 1 – zvyšování kyselosti – ca 14-17 hod. Lag a začátek log-fáze, minimum pH, titrační kyselost ještě 2-3 hod. roste (kys. máselná a octová), vývoj plynů, žádné spory Fáze 2 – maximální kyselosti a zvratu – ca 2 hod. Produkce plynů stagnuje, stoupá rychlost produkce ABE, žádné spory Fáze 3 – snižování kyselosti a tvorba ABE – ca 14 hod. Pokles kyselosti, pH roste jen málo (pufrováno bílkovinami), intenzivní tvorba ABE, rychlý pokles škrobu, vzácně spory Fáze 4 – dokvášení – ca 4-6 hod. Nepatrné zvýšení titrační kyselosti, pH se nemění, vývoj plynů i ABE ustává, sacharidy mizí, sporulace, autolýza buněk Celková doba 40-60 hod. podle podmínek (konc. sacharidu)

ABE Periodická fermentace

ABE Produkty fermentace ABE ca 3:6:1 Plyny – CO2 a H2 Molární poměry, stechiometrie Plyny – CO2 a H2 Čisté, využití pro výrobu suchého ledu, hydrogenace (ztužování tuků), výroba NH3, palivo Biomasa po úpravě jako krmivářská surovina

ABE Důležité podmínky a vlivy Nutnost sladit přípravu produkčního media když je zákvas ve 2. fázi – přítok samospádem, skleněné potrubí Probublávání CO2 k odstranění O2 Konc. sacharidů 5-7%, vyšší neúměrně prodlužují proces Tepelné optimum ca 37 oC Optimální pH 5-7,2 podle producenta (technologie) Inhibice kovy (Cu) i stimulace (Fe) – materiál zařízení Butanol začíná inhibovat od 0,2%, max. produkt 3% Hledání rezistentních kmenů zatím neúspěšné

ABE Problém mikrobiální kontaminace Mléčné bakterie, jiné klostridie, bakteriofág Nedostatečná sterilizace, kontaminace netěstsnostmi Nutný přetlak (využití kvasných plynů z paralelních tanků na začátku) Konkurence o substráty – jiné produkty, problémy s izolací ABE Fág likviduje produkční kmen

ABE Bateriová fermentace Baterie fermentorů, 1. aktivátor Inokulum a medium v aktivátoru 12-14 hod. pak postupné přečerpávání, aktivátor se doplňuje mediem ke zbytku zákvasu. Koncový tank se vyprazdňuje první, vyčistí, zakvasí a vše jde zpět. Trvání ca 42 hod.

ABE Izolace frakční destilací Různá uspořádání, propojení rektifikačních kolon s deflegmátory a dekantéry Značné rozdíly b.v. usnadňují frakcionaci Omezená misitelnost butanolu s vodou – dekantace

ABE Produkce ABE na kukuřičném škrobu

ABE Produkce ABE na melase

ABE Výtěžky a ztráty – podle technologie odchylky Ca 36% škrobu se přemění na ABE, tvoří ca 2% media Vyšší výtěžky pro hydrolyzáty hemicelulos Ztráty 4-10% Odpařováním – kvasné plyny, destilace, přečerpávání Vedlejší produkty ca 36 m3 CO2 a 24 m3 H2/100 kg škrobu Složení kvasných plynů kolísá během procesu – fáze Dělí se promýváním (věž) Bezpečnostní problematika Páry ABE, vodík Elektrická instalace, povrchy – plasty (elstat. výboje)

ABE Bilance materiálu

ABE

2,3-BDL Metabolický základ produkce Společná cesta z glukosy k pyruvátu Odlišnosti u různých mikroorganizmů Kvasinky přes acetoin redukcí Bakterie přes acetolaktát, acetoin a diacetyl Odlišnosti též co do vedlejších produktů Glycerol, formiát, vodík

2,3-BDL

2,3-BDL Kvasinky Bakterie 2 CH3CO.COOH CH3CH(OH).CO.CH3 CH3CH(OH).CH(OH).CH3 (TPP), - 2CO2 acetoin NADH 2,3-butandiol Bakterie 2 CH3CO.COOH CH3CO.C(OH).COOH CH3CH(OH).CO.CH3 (TPP), - CO2 CH3 - CO2 acetolaktát CH3CO.CO.CH3 CH3CH(OH).CH(OH).CH3 diacetyl

2,3-BDL Stereoisomery BDL

2,3-BDL Mechanizmy tvorby stereoizomerů 2,3-BDL

2,3-BDL Producenti

2,3-BDL Producenti Aerobacter aerogenes Bacillus polymyxa Fermentuje většinu monosacharidů i rafinosu, alkoholy, aerobní Bacillus polymyxa Má amylasu, fermentuje i škrob Za anaerobních podmínek produkuje též glycerol Bacillus subtilis Nemá amylasu Serratia marcescens Substrát glukosa, aerobní podmínky Další produkty – formiát, acetát, laktát, etanol

2,3-BDL Suroviny Škrobnaté po hydrolýze (mimo B. polymyxa) Cukernaté Obilí + 1% CaCO3 Cukernaté Melasa – přídavek fosfátu a výluhu sladových klíčků Sacharosa + 1% CaCO3 + otruby Cukrovka, třtina (Před)hydrolyzáty dřeva, sulfitové výluhy Pentosany Standartní úpravy

2,3-BDL Fermentační zařízení Vybavení podobné jako u ABE kvašení Navíc vzduchování U škrobnatých surovin separátor nerozpustného podílu

2,3-BDL Fermentační proces pro A. aerogenes Propagace Průběh kvašení 500 ml na vhodné sterilní půdě (melasa+fosfát+kvasničný autolyzát) – 24 hod., aerace 50 L propagátory, 48 hod. Produkční tanky – 1 – 10 m3, Průběh kvašení 14 – 16 hod. vzduchování, pak každých 5 hod. 10 min. vzduchování, jinak anaerobně (míchání) Celková doba ca 100 hod.

2,3-BDL Podmínky a vlivy Koncentrace cukru až 20%, vznikají však vedlejší produkty, lépe začít s 10% (i méně) a zbytek přítokem nebo v dávkách během fermentace Produkce stereoizomerů závisí na mikroorganizmu A. aerogenes – 5-14% L-, zbytek mezo- B. polymyxa – 98% i více D- B. subtilis – kolem 40% D- zbytek mezo- S. marcescens – až 100% mezo- Vzduchování ovlivňuje absolutní výtěžky i zastoupení vedlejších produktů (acetoin, etanol)

2,3-BDL Podmínky a vlivy Vzduchování ovlivňuje absolutní výtěžky i zastoupení vedlejších produktů (acetoin, etanol) pH ovlivňuje rychlost, výtěžky i zastoupení produktů Optimum se určuje pro každý proces laboratorně Živiny Přirozené suroviny není třeba přiživovat (obilí, brambory, řepa) Melasa – přídavek jak uvedeno, podle mikroorganizmu Přidání P, K, Mn – příznivý vliv Mo, Co, i Mn – snižují BDL, zvyšují produkci etanolu Podle producenta

2,3-BDL Produkce stereoizomerů BDL GM E.coli - optimalizace produkce, podobně u ABE

2,3-BDL Izolace, v médiu 3-4% BDL, b. v. 184 oC Oddestilování etanolu Filtrace, zahuštění (vakuová odparka) na 15% BDL Extrakce vodní parou ve vakuu Eventuality Esterifikace kys. octovou (katalyzovaná kys. sírovou), oddestilování esteru, termický rozklad na butadien Extrakce rozpouštědly – eter, butanol aj., lze regenerovat

2,3-BDL 1- fermentor, 2 – 2fázová extrakce s vodou, 3 – regenerace soli, 4 – odparka (stékající film), 5 – rektifikační kolona, 6 – kolona zachycení metanolu

2,3-BDL Srovnání separačních technik BDL

2,3-BDL Využití Rozpouštědlo Nemrznoucí směsi Plasty, umělý kaučuk – butadien

Glycerol Možnosti Zbytek při průmyslovém zpracování tuků Výroba mýdel – hydrolýza tuků na MK + glycerol Chemická syntéza Chlorace propenu na triCl-propan, hydrolýza Fermentační produkce Složitější, využívaná pro zpracování odpadů nebo při limitaci jiných způsobů Způsoby využívány podle užitečnosti, možností, dostupnosti surovin apod. Válečné podmínky, požadavek x snížená dostupnost olejů

Glycerol Metabolický základ Varianta etanolového kvašení I při výrobě etanolu se produkují ca 3% glycerolu v zápaře Přesměrování metabolitů NADH pro redukci DHAP místo acetaldehydu Zábrana redukce acetaldehydu Siřičitanový způsob CH3CHO + HSO3- CH3CH(OH). SO3- Alkalický způsob 2 CH3CHO CH3CH2OH + CH3COOH

Glycerol Produkce

Glycerol

Glycerol

Glycerol Producenti Bakterie Kvasinky S. cerevisiae, S. carlsbergensis Závisí na druhu substrátu, liší se produkcí (20-28% glycerol) Nemnoží se během fermentace, část hyne, ostatní botnají Adaptací se zvyšuje odolnost, znovu použité mají jen 15-20% úhyn Lze pak zvýšit konc. siřičitanu  vyšší výtěžky glycerolu Bakterie B. subtilis, více vedlejších produktů

Glycerol Suroviny Cukernaté Škrobnaté Čistá sacharosa, nejlepší, čistý produkt Ostatní zkvasitelné cukry Melasa – nevýhodou obsah aminosloučenin (AK, betain), tmavé produkty reakcí s invertním cukrem, přechází do glycerolu. Je levná, užívá se podle nároků na produkt. Škrobnaté Nutná hydrolýza, kyselá nebo enzymová Důležité přečištění, balasty přecházejí do glycerolu

Glycerol Fermentace – siřičitanový způsob Kvasinky představují komplex enzymů, nemnoží se Nutno dodávat větší množství, vyzkoušet adaptabilitu Suspenze lisovaného droždí ve vodě, přídavek zředěného roztoku siřičitanu a živin, inkubace ca 2 hod. – adaptace Zakvašení produkčního tanku 14% sacharosa (melasa), hydrogenfosfát amonný, MgCl2, siřičitan do 20% koncentrace Po 25-30 hod. se zákvas odtáhne ke zpracování

Glycerol Podmínky a vlivy Modifikace produkční fáze Prokvašené medium se dekantuje, odčerpá se ca 60%, centrifugací se separují kvasinky, vrací se do fermentace Doplní se sacharosa, kvasinky a siřičitan Rychlé kvašení (i 7-9 hod.) Úspora 60-75% droždí a 33% siřičitanu Lze opakovat 5-6 Jinak – namnožení adaptovaných kvasinek, užití výpalků ke zřeďování melasy místo vody aj. Teplota optimálně 30-32 oC

Glycerol Podmínky a vlivy Konc. sacharidu 12-14%, fermentace trvá do 30 hod. Vliv siřičitanu Produkce glycerolu efektivně roste do ca 20% siřičitanu (ca 25-30% výtěžek glycerolu vzhledem k cukru), pak již podstatně méně – nevyplatí se Koroze materiálu zařízení, nevhodné Fe, lépe Cu, Al, sklo, nerez Provzdušňování nemá vliv na proces, působí jako míchání, inhibuje sirné bakterie Kontaminace Bakterie zužitkovávající glycerol (E. coli, A. aerogenes aj.) Sirné bakterie (Desulfovibrio), produkce sulfidů, provzdušnění zabrání redukci siřičitanu

Glycerol Fermentace v alkalickém prostředí 5% Na2CO3 nebo K2CO3 příp. hydroxidy Více zastoupen etanol, je čistší (po destilaci) Delší doba kvašení, 4-5 dní Méně efektivní

Glycerol Izolace Centrifugace – kvasinky lze znova užít (ev. regenerace) Destilace – oddělení etanolu (příp. zachycení CH3CHO při dobrém chlazení), není dost čistý pro rafinaci Čeření (0,1% CaO), dekantace a filtrace (pevná fáze Zahuštění filtrátu a krystalizace siřičitanu – znovu se užije 16-20% glycerol, opětné čeření, zahuštění a krystalizace 60% glycerol, destilace s vodní parou (15-30 torr) Rafinační destilace

Děkuji za pozornost