Mikrobiologický ústav uvádí NA STOPĚ PACHATELE Díl sedmý A: 1) Nepřímý průkaz mikrůbů 2) Přímý i nepřímý průkaz virů L Autor prezentace: Ondřej Zahradníček (kontakt: zahradnicek@fnusa.cz). K praktickému cvičení pro Bi7170c

Hlavní obsah Úvod do serologie, precipitace a aglutinace Dynamika titru, KFR a neutralizace Reakce se značenými složkami Diagnostika virů I Diagnostika virů II

ÚVOD PRECIPITACE AGLUTINACE

Obsah této části prezentace Úvod – pohádka Antigen a protilátka Interpretace průkazů protilátek Geometrická řada a a počítání titrů Aglutinace a precipitace: přehled Aglutinace – příklady reakcí Precipitace – příklady reakcí Kontrolní otázky

Pohádka Bylo jednou jedno malé dítě, a tomu maminka koupila hračku, aby se naučilo poznávat tvary. Hračka byla plastová destička s dírami různých tvarů, a k tomu tvary, co patřily do těch děr. Jednou dítě řvalo, protože mu cosi nešlo. Maminka přiběhla: „Ale, dítě, nemůžeš rvát čtvereček do díry pro kolečko!“ Podívej, kolečko patří sem, čtvereček tam.

Jenže o pár dní později… …přišla maminka k dítěti do pokoje, a viděla, že se dítěti podařilo narvat kolečko do díry pro šestiúhelníček. I uvědomila si maminka, že pravidla sice platí, ovšem existují z nich občas i výjimky I v přírodě přece platí – pokud má určitý tvar svůj protitvar, stane se občas, že se dá dohromady i dvojice, která k sobě původně neměla patřit.

Poučení z naší pohádky Mikroby (ale i třeba rostliny a živočichové) mají na povrchu svých buněk antigeny. Když se setkají s naším tělem, začne naše tělo tvořit protilátky, které jsou vůči těmto antigenům specifické. Specifičnost má ovšem své meze. Někdy existuje zkřížená reaktivita, kdy protilátka reaguje i s antigenem, který je jen podobný tomu, který vyvolal její tvorbu Někdy se také tvoří protilátka proti určité látce, která není součástí mikroba, ale při infekci se uvolňuje například ze stěny cév. Nicméně většinou prokazujeme protilátky proti určitému mikrobu.

Antigen a protilátka

Antigen a protilátka Antigen = makromolekula pocházející z cizího organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha. (Anebo sice z organismu vlastního, ale v tom případě je na povrchu buněk přestárlých či vadných.) V mikrobiologii nás zajímají mikrobiální antigeny = části nebo produkty* mikrobiálního těla, které vzbuzují v hostiteli antigenní odpověď Protilátka = imunoglobulin, tvořený v těle hostitele (člověka, ale také zvířete) jako odpověď na antigenní výzvu *například toxiny bakterií

Metody lékařské mikrobiologie a jejich interpretace Přímé metody: detekce mikroba, jeho části nebo produktu. Příklady: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita = je jisté, že agens je NYNÍ přítomno. Nepřímé metody: detekce protilátek proti mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal hostitele v minulosti (nevíme, zda před týdny / měsíci / roky)

Dva způsoby, jak využít interakci mezi antigenem a protilátkou: Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu či ze speciální buněčné linie) + vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda

Ještě máme dva podtypy průkazu antigenu: Přímý průkaz antigenu ve vzorku: pracujeme s celým vzorkem a hledáme antigen. Příklad: pracujeme s mozkomíšním mokem a hledáme v něm typické původce zánětů mozkových blan (resp. jejich antigeny) Antigenní analýza: ze vzorku jsme už izolovali kmen a zkoumáme jeho antigen(y). Příklad: máme již vypěstovaný kmen meningokoka a chceme vědět, ke které seroskupině (B či C) patří. (Zpravidla se používá uvnitř bakteriálního druhu.)

Interpretace průkazů protilátek

Interpretace Průkaz antigenu je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta Průkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s tělem pacienta setkal: Množství protilátek (relativní – titr) a jeho změny v čase (dynamika titru – viz J07) Třída protilátek: IgM/IgG (více v J08) (Avidita protilátek)

Jak interpretovat nepřímý průkaz Akutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM, případně IgM i IgG Pacient po prodělané infekci: malé množství protilátek, pouze IgG (imunologická paměť) Chronická infekce: různé možnosti podle aktivity infekce, mikrobiálního druhu apod. 1 2 1 2

Jak provést reakci „kvantitativně“ Je velmi těžké zjistit koncentraci protilátek proti konkrétnímu antigenu (ne tedy celkové množství imunoglobulinů) v.jednotkách mol/l, mg/l apod. Ale dá se dělat jiná věc: mnohonásobně ředit pacientovo sérum. Reaguje-li i po mnohonásobném ředění   v séru je velké množství protilátky Reaguje jen při nevelkém zředění séra   v séru je jen malé množství protilátky

Geometrická řada a počítání titrů

Geometrická řada Technicky nejjednodušší způsob, jak ředit sérum pacienta, je použití geometrické řady s koeficientem dva. Vycházíme z neředěného séra, nebo ze séra o určitém předředění (např. 1 : 5, 1.:.10, 1 : 50 nebo podobně) V každém případě platí, že v každém dalším důlku je dvojnásobné ředění oproti předchozímu, například tedy řada 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160…

Počítání ředění v serologii Pozor, v serologii např. ředění 1 : 4 znamená jeden díl séra a tři díly fyziologického roztoku (tj. čtyři díly celkem)! Při „biochemickém“ počítání (počet dílů séra ku počtu dílů diluentu) bychom naše geometrické řady museli značit např. 1 : 9, 1 : 19, 1 : 39, 1 : 79 (namísto 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80). To by bylo značně nepraktické.

Geometrická řada: jak ji udělat a) bez předředění původního séra

b) s předředěním původního séra (zde například 1 : 100) Samozřejmě, předředění nemusí být zrovna 1 : 100, může to být třeba 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20 či jakékoli jiné.

Příprava geometrické řady Předpokládejme pro jednoduchost, že vycházíme z neředěného vzorku séra V první zkumavce smícháme se stejným objemem diluentu (fyziologický roztok),  ředění 1 : 2 Polovina směsi z ředění 1 : 2 je přemístěna do další zkumavky a smíchána s opět stejným množstvím diluentu  1 : 4 Jedna polovina z 1 : 4 ……  1 : 8 Atd., atd.

Titr Po naředění séra pacienta přidáme antigen V závislosti na konkrétním typu reakce buď přímo vidíme výsledek reakce (aglutinát, precipitát), nebo ho musíme znázornit přidáním dalších složek (např. komplementu, červených krvinek apod. V každém případě lze nakonec nějak odlišit pozitivní a negativní výsledky reakce Nejvyšší ředění, kde ještě vidíme pozitivní reakci, se nazývá titr.

Určení titru Titr – nejvyšší ředění, kde je pozitivní reakce. Máme-li dvě řady, je titrem nejvyšší ředění z obou řad dohromady.

Ne vždy potřebujeme titry! Titry nikdy neurčujeme, pokud jde o průkaz antigenu Někdy ale neurčujeme titry, přestože půjde o průkaz protilátek: jde totiž o screeningové reakce Příklad: Každá těhotná žena se vyšetřuje, nemá-li náhodou syfilis. První testy jsou screeningové a provádějí se jen jako kvalitativní. Všechny pozitivní nebo i pouze podezřelé reakce se ověřují specifičtějšími, tzv. konfirmačními reakcemi.

Aglutinace a precipitace: přehled

Precipitace a aglutinace – společné Precipitace a aglutinace jsou dvě nejjednodušší serologické reakce, kde pracujeme opravdu jen s antigenem a protilátkou bez dalších složek Buďto tedy dokazujeme antigen zvířecí (či monoklonální*) protilátkou, nebo protilátku laboratorním antigenem Pouze ve druhém případě zjišťujeme titry! *vyrobenou klonální populací plazmatických buněk

Precipitace, aglutinace, aglutinace na nosičích Precipitace: Antigeny jsou ve formě izolovaných makromolekul (jde tedy o koloidní antigen) Aglutinace: Antigen je součástí buňky mikroba (pracujeme tedy s.celými mikroby, říkáme, že antigen je korpuskulární) Aglutinace na nosičích: Původně izolované antigeny jsou navázány na cizí částici – nosič (latex, erytrocyt, polycelulóza)

Precipitace

Aglutinace

Aglutinace na nosičích

Aglutinace: příklady reakcí

Průkaz protilátek aglutinací v mikrotitrační destičce Určete aglutinační titry u protilátek proti yersiniím Pozitivní – nepravidelný chuchvalec Negativní – malé pravidelné kolečko Nezapomeňte, že titr = nejvyšší ředění s pozitivní reakcí. První důlek je ředěn 1 : 100, druhý 1 : 200 atd.

Demonstrace aglutinační reakce u tularémie (z foto MiÚ LF MU a FN USA): První řada: Aglutinát je viditelný v ředění 1:2 a 1:4, nikoli však již 1:8 a vyšším  titr je 1:4 Druhá řada: V žádném důlku není aglutinace  žádný titr, negativní reakce 1:2 1:4 1:8

Aglutinace na detekci protilátek proti yersiniím K+ pozitivní, titr = 1 : 200 Č. 1 negativní Č. 2 pozitivní, tit. ³ 1 : 400 Č. 3 negativní Č. 4 pozitivní, titr = 1 : 200 1:100 1:200 1:400 1:800 Aglutinace Sedimentace volných bakterií

Příklad aglutinace na nosičích: Treponema pallidum pasivní hemaglutinace (TPHA) Také zde je pozitivní reakce vznik „chuchvalce“, negativní sedimentace částic na dno důlku. Avšak je to červené: je to totiž aglutinace na nosiči, nosičem je erytrocyt Dnes se v tomto testu červené krvinky nahrazují polycelulózovými částicemi – můžete se pak setkat se zkratkou TPPA

Demonstrace TPHA (foto MiÚ LF MU a FN USA) +++ ++ + +/- - - - - Demonstrace TPHA (foto MiÚ LF MU a FN USA)

Příklad sklíčkové aglutinace k antigenní analýze: Testování kmene E Příklad sklíčkové aglutinace k antigenní analýze: Testování kmene E. coli, zda není Enteropatogenní Escherichia coli Člověk je tvor zdravě líný. Nikomu by se nechtělo zkoušet míchat testovaný kmen E. coli postupně se dvanácti séry. Proto Použijeme nejprve polyvalentní séra: nonavalentní sérum obsahuje protilátky proti devíti typům EPEC, trivalentní sérum IV proti zbývajícím třem. Tak je „pokryto“ všech dvanáct serotypů. Pozitivita = vločky Pouze pokud jedno ze sér je „+“, pokračujeme s (trivalentními a) monovalentními séry Pozitivita se projeví jako vločky v kapce Je to průkaz antigenu (přesněji antigenní analýza)  neurčují se tu žádné titry!

Průkaz EPEC – výsledek

Precipitace: příklady reakcí

Příklad průkazu protilátek precipitací – vyvločkovací reakce na syfilis – RRR Detekujeme protilátky, které jsou pozitivní u syfilis, ačkoli to nejsou protilátky proti Treponema pallidum, nýbrž proti kardiolipinu (látka, která se objevuje u syfilitiků) Opět provádíme pouze kvalitativně. První důlek je pozitivní kontrola, druhý negativní, pak má každý pacient (jen!) jeden důlek Smíchá se vždy 0,05 ml séra + 0,05 ml kardiolipinu

RRR, RPR, VDRL Netreponemové testy, tedy průkaz nespecifických antikardiolipinových protilátek mohou být provedeny v různých formátech VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) je flokulační (precipitační) test na sklíčku. RRR (rychlá reaginová reakce), je obdobou (úpravou) reakce VDRL, používají se jamky Podobná je také reakce RPR (rapid plasma reagin), kde je odečítání reakce vylepšeno o makroskopickou vizualizaci pomocí karbonových částic, nebo pigmentů.

Precipitace – mikroprecipitace v agaru Tzv. mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho Do důlku uprostřed je nalita tekutina obsahující antigen. Ten difunduje agarem. Obsahuje-li sérum protilátky, difundují proti němu a na jejich styku vznikne precipitační linie. + - Antigen 

Precipitace – prstencová precipitace k detekci antigenu Do Pasteurových pipet zabodnutých v.plastelíně postupně naléváme: 1) zvířecí sérum s protilátkami 2) čtyři různé extrakty kmenů Pozitivita: prstenec na styku tekutin Obrázek je jen ilustrační! V praktiku nevyjde pozitivní první, ale jedno z dalších sér!

Konec Treponema pallidum, původce syfilis

Poznámka k E. coli Escherichia coli je bakterie, která je normální složkou střevní mikroflóry. Na svém povrchu má kromě jiných typů antigenů také takzvané tělové O-antigeny. (Jsou to koncové části polycharidických řetěžců lipopolisachidů vnější membrány G– bakterií) Tyto O-antigeny nejsou u všech kmenů E. coli stejné. Naopak, existují stovky takzvaných serotypů v rámci druhu E. coli Ze všech těchto serotypů jen přibližně dvanáct vykazuje vyšší patogenitu u novorozenců a kojenců. Těmto serotypům se souhrnně říká EPEC – enteropatogenní Escherichia coli

Nepřímý průkaz syfilis – přehled TPHA – Tr. pasivní hemaglutinační test TPPA – dtto, místo krvinek polycelulóza Nepřímý průkaz syfilis – přehled Historický BWR – Bordet Wassermann Netr. Screeningové RRR – Rapid Reagin Test TPHA/TPPA* Treponemové Konfirmační ELISA FTA-ABS (nepř. imunofluor.) Western Blotting Historický, popř. superkonfirmace TPIT (Treponema Pallidum Imobilizační Test) = Nelson

Kontrolní otázky 1. V jakém typu vzorku se hledají protilátky? 2. V jakých typech vzorků se dají hledat antigeny? 3. Vysvětlete pojem „antigenní analýza“. 4. Znamená přítomnost protilátek vždy akutní infekci? 5. V jakých situacích se měří titry? 6. Jaký je rozdíl mezi precipitační a aglutinační reakcí? 7. Proč je nutno v případě pozitivity RRR reakce konfirmovat? 8. Lze aglutinační reakcí vyšetřit i protilátky proti koloidnímu antigenu? 9. Co znamená pojem "screeningová reakce"? 10. A ještě jedna  Hlavní obsah

KOMPLE-MENTFIXACE NEUTRA-LIZACE

Obsah této části prezentace Dynamika titru Komplement a jeho vlastnosti Komplementfixační reakce (KFR), její princip Řešení problémů s KFR Příklady použití KFR v praxi Neutralizační reakce – princip Jednotlivé neutralizační reakce ASLO a jeho význam Kontrolní otázky

Dynamika titru

Interpretace serologických reakcí Průkaz antigenu je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta Průkaz protilátek je nepřímá metoda. Jak odhadnout, kdy se mikrob s.tělem pacienta setkal: Množství protilátek (titr) a zejména změna tohoto množství (dynamika titru) Třída protilátek: IgM/IgG (více v J08) (Avidita protilátek)

Dynamika titru 1- akutní sérum 2 - rekonvalescentní 2 1 Průšvih je, že každý má jinou úroveň protilátkové odpovědi. Proto samotná hodnota titru mnoho neříká Změna titru vypovídá více. Jde-li o čerstvou záležitost, titr se vždy vyvíjí, nejprve stoupá, později zvolna klesá. 2 1

Proč nestačí samotný titr Někdy se stane, že málo reaktivní pacient má i v akutní fázi titr dosti nízký Velmi reaktivní pacient naopak i dlouho po infekci titr relativně vysoký

Párová a nepárová séra Párová séra = první vzorek je uchováván v.ledničce, dokud nepřijde i druhý (10–21 dní). Pak jsou oba hodnoceny naráz. čtyřnásobný vzestup se v tom případě má za signifikantní pro akutní infekci. Séra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto se zpravidla vyžaduje ještě jednoznačnější důkaz než čtyřnásobný titr

Dynamika titru – další aspekty Zvláštním případem je tzv. serokonverze – v prvním vzorku protilátky nejsou (ještě se nestihly vytvořit), v druhém už jsou. Takový důkaz je cennější než „důkaz čtyřnásobkem“ V některých případech místo vzestupu prokážeme pokles (subakutní infekce) Velikost titru rozhodně neodpovídá vývoji klinických příznaků. Množství protilátek často vrcholí, až příznaky zmizí.

Příklady různých projevů dynamiky titru 1 – 2: sérokonverze 3 – 4: vzestup titru 5 – 6: pokles titru

Komplement a jeho vlastnosti

Komplement součást nespecifické humorální imunity složitý kaskádový systém http://img.tfd.com/dorland/thumbs/complement.jpg

Komplementfixace (KFR) Komplement = jedna ze složek imunitní reakce Pro KFR používáme morčecí komplement. Pacientův komplement je před reakcí inaktivován teplem Komplement není schopen vázat se na samotný antigen Komplement není schopen vázat se na samotnou protilátku Komplement je schopen vázat se pouze na KOMPLEX obou Jsou-li antigenem beraní erytrocyty a protilátkou králičí protilátky proti nim, dojde po navázání komplementu k hemolýze. Lze se o tom přesvědčit v jednoduchém úkolu, který je obsažen v praktickém cvičení.

Komplement a jeho vlastnosti http://web.indstate.edu/thcme/micro/comp_fix.gif

Komplement fixační reakce (KFR), její princip

Pohádka 1 Byl jednou jeden zvědavý hlídač v parku. Chtěl vědět, jestli mládenec, který chodívá do parku ve stejnou dobu jako jedna slečna, k té slečně patří Uvažoval následovně: v parku je jediná lavička. Pokud patří k sobě, tak si jistě na lavičku sednou a budou se objímat Umístil proto na lavičku kudlibabky a řekl si, že pokud ti dva k sobě patří, nachytají na sebe při objímání kudlibabky z lavičky.

Pro ty, kdo nevědí, jak vypadají kudlibabky http://www.ordinace.cz/clanek/lopuch-vetsi-lopuch-plstnaty/

Jak to ale poznat… …když mládenec i dívka odešli jiným východem? Hlídač si uvědomil, že za chvíli přijde na návštěvu jeho neteř se svým přítelem. Jak je zná, určitě se cestou zastaví u lavičky a budou se objímat. Hlídač to vymyslel: pokud neteř s přítelem budou mít na sobě kudlibabky, pak je nevychytala ta první dvojice – žádná dvojice to nebyla. Pokud kudlibabky mít na sobě nebudou, tak k sobě první dvojice patří.

Poučení z naší pohádky Dnes máme na programu komplementfixaci, poměrně složitou reakci. Nejenže ke zviditelnění komplexu antigen-protilátka používáme komplement, ale navíc ještě přidáváme další dvě složky – tzv. indikátorovou dvojici. Tato dvojice je tvořena indikátorovým antigenem (beraní erytrocyty) a indikátorovou protilátkou (amboceptor = králičí protilátky proti beraním erytrocytům).

Princip KFR Sérum pacienta se smíchá s laboratorním antigenem (nebo, u přímé KFR, se smíchá pacientův vzorek se zvířecími protilátkami). Přidá se komplement. V pozitivním případě se naváže (je schopen se navázat jen pokud se vytvořil komplex Ag-Ig) Ve druhé fázi přidáme indikátorový systém (beraní erytrocyty + amboceptor). U pozitivní reakce indikátor zůstává nedotčen. U negativní reakce dojde k jeho hemolýze.

Princip KFR

Co dělá komplement s indikátorovým systémem K hemolýze je nutná přítomnost beraních (ne králičích) erytrocytů, amboceptoru a komplementu. Chybí-li byť jediná složka, nebo je nahrazena jinou, k hemolýze nedojde. Beraní ery + amboceptor bez komplementu  není hemolýza Beraní ery + komplement bez amboceptoru  není hemolýza Králičí ery + komplement + amboceptor  není hemolýza Beraní ery + komplement + amboceptor  hemolýza

Použití KFR KFR lze použít pro diagnostiku mnoha, zejména virových infekcí Jako i jiné serologické reakce se KFR používá k průkazu antigenu či protilátky Pro zjednodušení uvádíme v tomto praktiku pouze průkaz protilátky Berme to tedy tak, že máme laboratorní antigen, který konfrontujeme se sérem pacienta (kde hledáme protilátky)

Řešení KFRůserů

Problémy s KFR Příliš mnoho komplementu  falešná negativita. Co dělat? Titrovat komplement Některá složka séra sama o sobě vyvazuje komplement (složka antikomplementarity): falešně pozitivní výsledky. Co dělat? Provést test antikomplementarity, tj. vše jako v normální reakci, ale bez antigenu (V pohádkovém příběhu odpovídá bezdomovci, který zválí lavičku a sám na sebe nachytá všechny kudlibabky, a to i tehdy, když je chlapec nemocný a do parku vůbec nepřijde)

Titrace komplementu Pro reakci potřebujeme množství morčecího komplementu, které není moc velké ani malé. Proto zjišťujeme, jaké množství komplementu hemolyzuje pracovní jednotku krvinek s amboceptorem (hemolytická jednotka) Příliš mnoho komplementu  falešná negativita (příliš mnoho kudlibabek  zbude i na neteř a jejího přítele)

Test antikomplementarity NENÍ

Příklady použití KFR v praxi

Klinická situace A Pacient s dlouhotrvajícími respiračními problémy, málo klinických projevů, nejpravděpodobnější diagnóza atypické pneumonie Atypická pneumonie může být způsobena mnoha respiračními viry, avšak také některými bakteriemi (Mycoplasma, Chlamydia) Případná mykoplasmová/chlamydiová etiologie by znamenala účinek antibiotik. U virů by antibiotika smysl neměla.

Respirační patogeny Celá serologická destička patří jednomu pacientovi. Máme šest respiračních patogenů, každý je ve dvou řádcích (akutní vzorek a rekonvalescentní). První sloupec je test antikomplementarity Následuje sedm ředění séra – ve druhém sloupci 1 : 5 a pak geometrickou řadou s.koeficientem dva. Kromě virů je ve škále i bakterie Mycoplasma pneumoniae

Klinická situace B Máme tři pacienty s podezřením na klíšťovou encefalitidu, všichni mají neurologické potíže a anamnézu přisátí klíštěte Klíšťová encefalitida je nemoc poměrně běžná ve střední Evropě. Ačkoli má horší průběh u dospělých (zejména seniorů), lidé pohříchu nechávají očkovat spíše své děti než své rodiče.

Klíšťová encefalitida – příklad průkazu Opět testujeme protilátky, tentokrát proti klíšťové encefalitidě. v prvním řádku je pozitivní kontrola ve 2. a 3. řádku první pacient ve 4. a 5. řádku druhý pacient v 6. a 7. řádku třetí pacient První z obou řádků vždy odpovídá akutnímu, druhý rekonvalescentnímu vzorku séra. V prvním sloupci jsou opět testy antikomplementarity, následuje ředění geometrickou řadou od ředění 1 : 4

Klinická situace C Máme několik pacientů, kteří mají být prověřeni na protilátky proti toxoplasmose (Toxoplasma gondii je tkáňový parazit, jeho definitivním hostitelem je kočka) Seronegativita znamená, že se pacient nikdy s infekcí nesetkal*. Seropozitivita vyžaduje bližší zkoumání (další odběr, event. ELISA pro ověření třídy protilátek) *nebo to bylo tak nedávno, že se ještě nestihly vytvořit protilátky.

Toxoplasmosa – příklad průkazu protilátek Destička patří pozitivní kontrole (první řádek) a šesti pacientům (druhý až sedmý řádek). Hledáme protilátky proti toxoplasmose. V prvním sloupci jsou opět testy antikomplementarity, následuje ředění geometrickou řadou od ředění 1 : 8. V tomto případě nesledujeme dynamiku titru (každý pacient má jen jeden řádek).

Neutralizační reakce – princip

Pohádka 2 Byl jednou jeden krvežíznivý toxin, a ten dostal chuť na červenou krvinku Tento toxin měl ovšem zároveň vlastnosti antigenu, proti kterému se tvoří protilátky A jak se tak ten toxin chystal rozbít krvinku, postavila se před něj protilátka, navázala se na něj a nedovolila mu krvinku rozbít Červená krvinka se radovala, a spolu se sestřičkami vesele sedimentovala na dno

Poučení z naší pohádky Dnes máme na programu též neutralizaci Tato reakce se uplatní v případě virů nebo bakteriálních toxinů, které mohou být přímo neutralizovány příslušnou protilátkou Celá bakterie se zpravidla jen tak jednoduše neutralizovat nedá Většina aplikací neutralizace je tedy ve virologii. Výjimkou je však nejběžnější serologická reakce vůbec – reakce ASLO

Neutralizační reakce: obecný princip Protilátky fungují několika způsoby. Jeden z nich je přímá neutralizace. Tento způsob se zřídka vidí u celých bakterií. Pozorujeme ho u virů nebo bakteriálních toxinů Nicméně někdy protilátky neutralizují i určitou charakteristiku celé bakterie, např. pohyblivost Treponema pallidum u tzv. Nelsonova testu (TPIT).

Neutralizace schématicky Protilátka (Ig) brání efektu toxinu/viru na buňku / krvinku + – Buňka ve tkáňové kultuře či červená krvinka Buňka ve tkáňové kultuře či červená krvinka Toxin či virus Protilátka Toxin či virus

Příklady neutralizačních reakcí Neutralizován Objekt Reakce Toxin bakterie (hemolyzin) Erytrocyt hemolýza ASLO Virus Erytrocyt shlukování HIT Buňka efekt metabolický VNT

Jednotlivé neutralizační reakce

ASLO Princip: Protilátka blokuje hemolytický efekt toxinu (streptolyzinu O) na krvinku. Pozitivní je tedy zábrana hemolýzy se sedimentací krvinek (podobně, jako u KFR, ale ze zcela jiného důvodu) Panel se odečítá naležato. Obsahuje pozitivní kontrolu a sedm pacientů. Titr nad cca 200 znamená riziko, že pacient je ohrožen pozdními následky streptokokové infekce.

Postup ředění séra – ASLO Jinak obvyklý postup (ředění geometrickou řadou s koeficientem 2) by byl v tomto případě příliš hrubý, potřebujeme jemnější ředění. Jde sice o geometrickou řadu, avšak s koeficientem pouze 1,2 (a to ještě přibližně)

HIT Hemaglutinačně Inhibiční Test Protilátka neutralizuje virové shlukování krvinek (in vitro vlastnost většiny virů) Shluk krvinek („bramboroid“) = negativní výsledek. Sedimentace = pozitivní Příklad použití: Můžeme odečíst HIT u klíšťové encefalitidy – u každého pacienta akutní a rekonvalescentní sérum. Interpretace výsledků párových sér je u neutralizace samozřejmě stejná jako u kterékoli jiné reakce

Zapamatujte si: HIT není aglutinace, ale neutralizace virového shlukování krvinek HIT se liší od reakce ASLO především tím, že krvinky nejsou hemolyzovány, ale shlukovány. Stejné je naopak to, že specifická protilátka dokáže příslušnému efektu zabránit Průkaz protilátek proti klíšťové encefalitidě pomocí HIT je „už zase“ klasický nepřímý průkaz (na rozdíl od ASLO)

HIT u klíšťové encefalitidy: příklad klinické situace Máme několik pacientů s podezřením na klíšťovou encefalitidu, již testovaných pomocí komplementfixace Nyní jsme se rozhodli k ověření výsledků provést nezávislý test

VNT (nepleťte si to s TNT  ) Virus Neutralizační Test Buněčná kultura bývá poškozena virem. Poškození virem  změna pH  změna barvy ze žluté na červenou (pro zapamatování: buňky, zprzněné virem, se rdí, ač svému neštěstí nemohly zabránit) Jsou-li přítomny protilátky, mohou tomuto zprznění buněk zabránit. Buňky tedy nemají důvod se rdít a zůstávají žluté

VNT – klinická situace Pacient R. S., 35 let, má chronickou hrudní bolest. Kardiologické vyšetření ukázalo podezření na zánět srdečního svalu (myokarditidu) Jelikož coxackieviry jsou častými původci myokarditid, bylo rozhodnuto prověřit přítomnost protilátek proti těmto virům

VNT – příklad použití u coxsackievirů Celý panel patří vyšetření jednoho pacienta. Liché řádky = akutní sérum, sudé = rekonvalescentní. Co dva řádky, to jeden coxsackievirus (B1 až B6) V prvním sloupci je ředění 1 : 5, dále opět 1 : 10 atd. V posledním sloupci jsou kontroly. Je-li v tomto sloupci šest žlutých a šest červených důlků, je vše v pořádku Titr je určen posledním důlkem, který má nezměněnou (žlutou) barvu Vyjde-li u dvou coxsackievirů signifikantní (alespoň čtyřnásobný) vzestup titrů, může sice jít o koinfekci, pravděpodobnější je však zkřížená reaktivita u toho coxsackieviru, kde je nižší titr

ASLO a jeho význam

Co je to antistreptolyzin O a proč ho prokazujeme Po každé streptokokové infekci se objevují protilátky, často včetně protilátek proti streptokokovému toxinu – streptolyzinu O. Někdy se však stane, že množství těchto protilátek po infekci neklesá, naopak stoupá. Protilátky se totiž vážou na některé struktury hostitelského organismu (autoimunita), roztáčejíce „bludný kruh“. V takovém případě jsou tedy paradoxně nebezpečnější protilátky než patogen, proti kterému nás měly chránit.

Pamatujte: ASLO není nepřímý průkaz, přestože hledáme protilátky. Nepátráme tu po patogenovi, určujeme samotné protilátky, jež mohou být nebezpečné Indikací k vyšetření ASLO je podezření na tzv. pozdní následky streptokokových infekcí – akutní glomerulonefritida či revmatická horečka

Revmatická horečka http://mednote.co.kr

Akutní glomerulonefritis Difusní zánětlivá buněčná infiltrace a mesangiální hypercelularita (barvení hematoxylin-eosin, původní zvětšení 200×) www.ispub.com

Akutní glomerulonefritis II iws.ccccd.edu

Princip vyšetření ASLO: neutralizace hemolýzy Všimněte si, že v.angličtině se ASLO označuje jako ASO. Zrada je, že zkratka ASLO přitom také existuje a označuje stafylolyzin.

Konec http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/emimages.html

Virus klíšťové encefalitidy Klíšťová encefalitida sice postihuje často děti, závažné příznaky má však spíše u dospělých. Přesto se dospělí málokdy nechají očkovat. V první fázi připomíná chřipku, ve druhé příznaky meningeální či mozkové. Smrtnost infekce je 1–5 %. Jde o typický arbovirus, zdrojem jsou hlodavci Diagnostika je nejčastěji nepřímý průkaz

Další flavivirové encefalitidy a horečky Kromě středoevropské klíšťové encefalitidy existují ještě další klíšťové encefalitidy. Ruská jaroletní je druhým podtypem k té naší, trochu méně příbuzná je skotská „louping ill“ a omská hemorrhagická horečka. Dále existuje japonská encefalitida, kterou přenášejí komáři rodu Culex. S ní je příbuzná také západonilská horečka, kterou rovněž přenášejí komáři. Zřejmě se vyskytuje i jako domácí onemocnění v okolí Lanžhota.

Klíště Ixodes ricinus http://www.presse.uni-wuppertal.de/archiv/output/okt98

Virus klíšťové encefalitidy http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm

Toxoplasma gondii Je to prvok, který je přenášen kočkami, i když chovatelé psů jsou ve větším riziku (protože na srsti donesou domů částečky kočičího trusu) Většina infekcí u imunokompetentních osob je bez příznaků nebo se projeví jen zvětšenými uzlinami, které zase odezní Nebezpečná je oční forma Nebezpečná je také infekce plodu, zejména v.prvním trimestru

Toxoplasma gondii http://fullmal.hgc.jp/tg/icons/Toxo_ultrastructure.gif

Životní cyklus toxoplasem Dole: toxoplasmová cysta v mozku http://www.antoranz.net/CURIOSA/ZBIOR3/C0311/03-QZC08043-3_Toxoplasma.jpg http://web.indstate.edu/thcme/micro/parasitology

Toxoplasma gondii http://webdb.dmsc.moph.go.th/ifc_nih/applications/pics/Toxoplasma.jpg http://www.smittskyddsinstitutet.se/upload/Analyser/ToxoplasmaSB.jpg

Toxoplasma – životní cyklus http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/images/ParasiteImages/S-Z/Toxoplasmosis/Toxoplasma_LifeCycle.gif

U některých osob ovšem může vzniknout například toxoplasmová retinitida… http://web.indstate.edu/thcme/micro/parasitology

Smrtnost (letalita) a úmrtnost (mortalita) Smrtnost čili letalita je podíl osob, které umřou na určitou nemoc, k celkovému počtu nakažených touto nemocí Úmrtnost čili mortalita je naopak průměrný počet osob, které zemřou na tuto nemoc (obvykle vyjádřený na 100 000 obyvatel a jeden rok)

Coxsackieviry: přehled čeledi Picornaviridae Do čeledi Picornaviridae patří z virů významných pro člověka patří do této čeledi především enteroviry, (název ukazuje na fekálně-orální přenos většiny z nich, ale vlastní infekce probíhají spíše mimo střevo!) dále se dělí na polioviry – viry dětské obrny coxsackieviry a echoviry novější enteroviry 68, 69, 70 a 71 rhinoviry – viry rýmy virus hepatitidy A

Coxsackieviry – více o nich Existují coxsackieviry A1–A22, A24 a B1–B6 Diagnostika spočívá v izolaci viru na novorozených myšatech či tkáňových kulturách Nepřímá diagnostika je obtížná kvůli zkříženým reakcím; používá se vlastně jen u skupiny B při podezření na myokarditidu

Coxsackieviry – patogenita CNS: aseptické meningitidy (většina typů) herpangina (A typy, hlavně A4) tzv. hand-foot-mouth disease (A16) dýchací infekce (všechny typy) myokarditida a jiné svalové choroby (B typy) lymfadenitida (všechny typy) souvislost s některými typy diabetes mellitus (skupina B)?

Kontrolní otázky Hlavní obsah Proč se pro KFR nepoužívá pacientův vlastní komplement a používá se místo toho morčecí? Jaké typy chyb vyvolává antikomplementarita séra? Jaké typy chyb vyvolává příliš velké množství komplementu? Proč nelze dvojnásobný vzestup titru považovat za signifikantní? (Uvažujte o chybě měření) Proč je u reakcí, jako je KFR, doporučeníhodné používat párová séra? Co znamená termín „serokonverze“? V jakých klinických situacích má význam vyšetřovat ASLO? Proč není vhodné hovořit o ASLO jako o „nepřímé metodě detekce mikroba“ navzdory faktu, že jde o průkaz protilátek? Každý virus nemá schopnost aglutinovat erytrocyty – jak to ovlivní možnost použití HIT v diagnostice? Jaká je anglická zkratka reakce ASLO ? Proč se neutralizační reakce jen zřídka používají v bakteriologii? A ještě jedna  Hlavní obsah

REAKCE SE ZNAČENÝMI SLOŽKAMI

Obsah této části prezentace Úvod (pohádka) Třídy protilátek Reakce se značenými protilátkami: přehled Imunofluorescence a RIA ELISA: princip ELISA: praktické odečítání Imunobloty (Western blotting) Imunochromatografické testy Kontrolní otázky

Pohádka Byla jednou jedna námořnice*, a ta měla na palubě různé věci přivázané, aby jí neodplavaly. Dalekohled měla přivázaný na záchranné kolo, to zase na záchranný člun, a ten byl připevněný k palubě. A tak to vydrželo i největší vlny. Jednou se na palubě objevil její muž. Chtěl si vyzkoušet záchranné kolo. Odvázal z něj dalekohled a odvázal ho z člunu. Přišla vlna – a dalekohled uplaval. *Původní pohádka o námořníkovi a jeho ženě byla upravena v rámci boje s genderovými stereotypy.

Poučení z naší pohádky Reakce se značenými složkami jsou založeny na tom, že postupně navazujeme jednotlivé složky reakce po každém kroku reakce probíhá promytí Promytí odstraní vše, co není navázáno Negativní reakce je taková, ve které chybí jeden článek řetězce postupně na sebe navázaných složek. Další složky už pak nejsou spojeny s povrchem, a tak jsou při promytí odstraněny.

Třídy protilátek

Průběh protilátkové odpovědi Protilátky IgM se tvoří jako první, ale také jako první mizí. Neprocházejí placentou  jejich nález u novorozence je svědectvím jeho infekce Protilátky IgG se tvoří později a zůstávají jako imunologická paměť přítomny dlouhodobě. Procházejí placentou (novorozenec je tedy může mít od matky)

Protilátky ostatních tříd Protilátky třídy IgA se uplatňují hlavně u slizniční imunity, a tedy u infekcí, kde branou vstupu je sliznice (například gastrointestinální). U některých infekcí se vyšetřují místo protilátek IgM (například u toxoplasmosy) Protilátky třídy IgE se vyskytují u alergií a infestací červy. Zpravidla se však nestanovují specifické IgE proti nějakému patogenovi S protilátkami IgD se v mikrobiologii nepracuje

Reakce se značenými protilátkami: přehled

Reakce se značenými složkami Na povrch se postupně navazují jednotlivé složky Místo jedné ze složek se pokusíme navázat vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že danou složku možná obsahuje Je-li to pravda, složka se naváže Pokud se všechny složky postupně navážou, vznikne nepřerušený řetězec Na konci řetězce je vhodné značidlo

Promytí a jeho význam Pokud by v reakci zůstalo přítomno i to, co se na nic nenavázalo, nedokázali bychom odlišit pozitivní reakci od negativní Proto po každém kroku reakce následuje promytí, po kterém zůstanou přítomny pouze složky navázané na pevný povrch Je-li řetězec přerušen, odplaví promytí vše za místem přerušení

Příklad pozitivního a negativního průběhu Pacientův vzorek + Laboratorní protilátka Hledaný antigen Značená laboratorní protilátka (detekce) – Laboratorní protilátka Antigen chybí Značená laboratorní protilátka Není navázaná  je odplavena  nemůže být detekována POVRCH (sklíčko nebo dno důlku v destičce pro serologii)

Typy značidel Fluorescenční barvivo je značidlem u imunofluorescence Radioizotop je značidlem u reakce RIA Enzym je značidlem u reakce ELISA Western blotting je zvláštním případem reakce ELISA, kde jednotlivé antigeny jsou elektroforeticky rozděleny Používáme-li jako značidlo enzym, je poslední složkou přidanou do reakce ještě příslušný substrát – tedy jeden krok navíc.

Imuno-fluorescence a RIA

Imunofluorescence www.biologie.uni-hamburg.de

Imunofluorescence www.amsbio.com www.kcl.ac.uk www.bindingsite.com

Pozitivní výsledek u přímé i nepřímé imunofluorescence vypadá stejně

Příklady imunofluorescence (diagnostika Treponema pallidum) Výhoda: Povrchem je tu podložní sklíčko. To nám umožňuje vidět tvar mikroorganismů. Přímá imunofluorescence (Povrch)-(antigen)-(značená protilátka) Nepřímá imunofluorescence (Povrch)-(antigen)-(protilátka)-(značená protilátka proti lidské protilátce)

Reakční schémata u imunofluorescence A: Treponema pallidum – od pacienta B: Značená protilátka proti Treponema pallidum (laboratorní) C: Treponema pallidum – z laboratoře D: Protilátka proti Treponema pallidum – od pacienta E: Značená labor. protilátka proti lidské protilátce (konjugát)

Radioimunoesej (RIA) darc.tbzmed.ac.ir www.chbr.noaa.gov

ELISA: princip

ELISA www.genprice.com

ELISA www.cellsignal.com virology-online.com

ELISA – proč je tak oblíbená U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví jednoduše: intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá. Sytá barva = vysoce pozitivní. Nenáročnost z hlediska nákladů a nulové radiační nebezpečí je výhodou oproti radioimunoassayím Možnost automatizace a menší požadavky na odečítajícího jsou velkou výhodou oproti imunofluorescenci

Možnosti uspořádání složek bleděmodře vždy složka pocházející ze vzorku získaného od pacienta Povrch-antigen-protilátka-značidlo (P) Povrch-protilátka-antigen-protilátka-značidlo (P, např. průkaz HBsAg) Povrch-antigen-protilátka-antigen-značidlo (N) Povrch-antigen-protilátka-konjugát-značidlo (N) Konjugát je značená protilátka namířená proti lidské protilátce

Význam konjugátu Konjugát se používá zpravidla u reakcí nepřímého průkazu (průkaz protilátek) Je to protilátka, pro kterou je antigenem lidská protilátka, např. IgM nebo IgG Dokáže být selektivní proti určité třídě lidské protilátky Použití konjugátu je tedy podstatou možnosti selektivního průkazu jednotlivých tříd protilátek

ELISA k detekci protilátky: 1. Pozitivní (hledá se IgM, IgM přítomna) Všechny složky se postupně navazují. Dojde k.enzymatické reakci – změně barvy v důlku

ELISA k detekci protilátky: 2 ELISA k detekci protilátky: 2. Negativní I (hledá se IgM, žádné protilátky) V séru pacienta nejsou protilátky. Konjugát je odplaven, v důlku není žádná změna.

ELISA k detekci protilátky: 3 ELISA k detekci protilátky: 3. Negativní II (hledá se IgM, přítomny IgG) V séru pacienta jsou jen IgG protilátky. Konjugát je odplaven, ke změně barvy důlku nedojde

ELISA: praktické odečítání

ELISA – praktické provedení Zpravidla máme k dispozici destičku s.jamkami. Na rozdíl od klasických serologických reakcí má každý pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto, že nezjišťujeme titry Před vlastními důlky pacientů mohou být důlky: Bl – blank (pro kalibraci spektrofotometru) K- a K+ – pozitivní a negativní kontrola Cut off (c. o., dva či tři důlky) – „odsekávají“ pozitivní výsledky buď ostře, nebo s rozmezím plus mínus 10 %) Výrobce dodává „vzorky“ s negativní (K–), pozitivní (K+) a právě hraniční (c. o.) hodnotou absorbance Vždy záleží na konkrétní reakci ELISA a jejím provedení. Někdy chybí blank, někdy není cut off přímo obsažen v destičce, ale počítá se jako průměr negativních kontrol + konstanta.

ELISA – ukázka (foto MiÚ LF MU a FN USA)

Příklad reakce ELISA k průkazu antigenu (antigen Helicobacter pylori) U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá Intenzitu zbarvení lze měřit spektrofotometricky Za pozitivní se považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“ Obvyklý princip: Povrch-protilátka-antigen-protilátka-enzym-substrát

Příklad reakce ELISA k průkazu protilátek U nepřímého průkazu reakcí ELISA se zpravidla hodnotí zvlášť protilátky IgM a IgG V daném případě se místo IgA používá IgM Za pozitivní se opět považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“ Často existuje pole hraničních hodnot, např. výsledky mezi 90 % a 110 % cut off se hodnotí jako „hraniční“, pod 90 % jako „negativní“, nad 110 % jako „pozitivní“ Princip zpravidla: Povrch-antigen-protilátka-konjugát-enzym-substrát

Příklad uspořádání reakce ELISA při průkazu protilátek BL 4 K- 5 6 K+ 7 8 1 9 2 10 3 11 IgA IgG

 Western blotting

Western blotting Název – slovní hříčka (badatel Southern) Prakticky je to ELISA, ale směs antigenů je rozdělena elektroforeticky na jednotlivé antigenní determinanty Je tedy přesnější a pomáhá zejména tam, kde klasická ELISA troskotá na zkřížené pozitivitě např. příbuzných mikroorganismů V rámci serologických reakcí je výjimečný tím, že se nepoužívá k průkazu antigenu (jen protilátky)

Western blotting – princip 1: původní antigen (směs) 2: uvolnění jednotlivých antigenů detergentem 3: elektroforetické rozdělení antigenů 4: „přesátí“ rozdělených antigenů na nitrocelulózu 5: reakce ELISA (přítomny jsou jen některé protilátky)

Western blot – vzhled (obrázek z foto MiÚ LF MU a FN USA)

Příklad odečtení Western blotu (u lymeské boreliózy) Jsou-li přítomny alespoň dva specifické pruhy (zvýrazněné na šabloně)  hodnotí se jako pozitivní Výjimky: u IgG stačí, je-li pozitivní jen jeden pruh, je-li to pruh vlsE (je vysoce specifický) u IgM stačí, je-li pozitivní jen jeden pruh, je-li to pruh ospC (je vysoce specifický)

Imuno-chromatografické testy

Imunochromatografické testy Imunochromatografické testy jsou založeny na navazování jednotlivých komponent podobně jako předchozí Důležitým rozdílem je, že zde není promytí. Některé komponenty jsou navázány na povrch na určitých místech (testovací a kontrolní místo), další se hned naváží na testovanou složku a spolu s ní cestují porézní vrstvou. V pozitivním případě je zpravidla pozorován proužek u testu i u kontroly, v negativním jen u kontroly.

Příklad principu imunochromatografického testu http://www.bl-inc.jp/images/immuno_ge.gif

Princip (jen jedna z možností) Testovací oblast Kontrolní oblast + –

Vysvětlení k předchozí animaci V pozitivním případě jsou některé značené protilátky navázány na antigen, a uchytí se v testovací oblasti. Některé další molekuly dojdou až do kontrolní oblasti V negativním případě všechny značené protilátky přicházejí do kontrolní oblasti protilátka fixovaná k povrchu značená protilátka + antigen značená protilátka protilátka proti značené protilátce

Výhody imunochromatografických testů Jsou velmi rychlé (desítky minut) Jsou velmi jednoduché  některé se nedělají v laboratoři, ale přímo u pacienta Jsou dostatečně přesné Mohou být použity pro mnoho účelů (všetně mimomikrobiologických, například těhotenský test) Nevýhoda: jsou poměrně drahé ve srovnání s tradičními testy

Typický mikrobiologický příklad Clostridium difficile je důležitý střevní patogen. Je to anaerob, žijící i za normálních podmínek ve střevě. Za určitých okolností (zpravidla širokospektrných antibiotik, zejména linkosamidů) C. d. se přemnoží a jeho toxiny jsou nadprodukovány Testy produkce obou toxinů (A/B) ukazují pozitivitu obou modrých proužků (testovacího i kontrolního). Pozitivita pouze kontrolního proužku ukazuje, že test je v pořádku, je však negativní.

Konec (Obraz s názvem Protilátka) www.twitchfilm.net/archives/003401.html

Treponema pallidum Spirocheta, původce syfilis Syfilis je klasická pohlavní nemoc. Přenáší se výhradně sexuálně. Jde ovšem o systémové onemocnění – v pokročilých stádiích postihuje celé tělo postiženého člověka (gummata, disekce aorty, neurolues, psychické příznaky) Některé poddruhy T. pallidum a některá jiná treponemata způsobují jiné choroby (framboesie – yaws, T. pertenue) Některá treponemata jsou i nepatogenní www.primer.ru

Borrelia burdorferi sensu lato http://www.pasteur.fr Borrelia burdorferi sensu lato Jiná spirocheta, způsobující Lymeskou nemoc (podle města Old Lyme v USA) a dále klasifikovaná na Borrelia burgdorferi sensu stricto (= „v užším slova smyslu“), Borrelia garinii, Borrelia afzelii a další Nemoc je charakterizována tzv. erythema migrans, pak obvykle následují další příznaky Zatímco v USA se vyskytuje zejména B. b. sensu stricto a typické jsou kloubní příznaky, v Evropě jsou častější B. garinii a B. afzelii a typická je neuroborrelióza Kromě lymeské nemoci vyvolávají borrelie (jiné druhy) návratnou horečku (B. duttoni, B. recurrentis)

http://vietsciences.free.fr Helicobacter pylori Peptické (tedy gastrické či duodenální) vředy jsou onemocněním, které vzniká souhrou více příčin. Takovým onemocněním říkáme obvykle multifaktoriální. Dodnes se nejen mezi praktickými lékaři, ale i mezi specialisty liší názory na podíl spirálovité tyčinky (ne spirochety!) Helicobacter pylori na vředové onemocnění. Jisto je, že jsou i zdraví lidé s helikobakterem, stejně tak je ale jisto, že helikobakter svůj, nikoli nevýznamný, podíl na onemocnění má.

Kontrolní otázky Hlavní obsah 1. Jakou diagnostickou hodnotu přisuzujete nálezu antigenu metodou ELISA a nálezu protilátek stejnou metodou? Uvažujte obecně. 2. Jaký klinický materiál je vhodný pro průkaz antigenu a jaký pro průkaz protilátek? 3. V čem se liší a v čem jsou společné reakce ELISA a western blot? 4. Proč se u průkazu protilátek metodou ELISA zpravidla nepoužívá ředění séra geometrickou řadou ? 5. Jaký význam má (opět uvažujte obecně) průkaz protilátek tříd IgG, IgM a IgA? 6. Které protilátky procházejí placentou a které ne? 7. Proč není možno jednotlivé třídy protilátek prokazovat „klasickými“ sérologickými metodami (aglutinace, KFR, neutralizace)? 8. Existují i další mikrobiologické možnosti použití imunochromatografických testů kromě průkazu toxinu Clostridium difficile? 9. Co je to cut off? 10. Jak se nazývá přístroj, který se (kromě řady jiných využití) používá i k vyhodnocování výsledků reakcí ELISA? Hlavní obsah

VIRY I

Obsah této části prezentace Viry Viry hepatitid HIV Diagnostika hepatitid a HIV infekce Praktické aspekty diagnostiky Kontrolní otázky

Viry

Příběh Kupte si ty broskve, paní, volal prodavač na exotickém trhu. Paní Jitka broskve koupila a odnesla do hotelu. V hotelovém pokoji si je chtěla oprat, ale ouha – neteče voda. Co teď? Paní Jitka zaváhala, ale chuť na šťavnaté broskve byla silnější. Několik jich sním, přece se nemůže nic stát. Po návratu z dovolené paní Jitka nápadně zežloutla…

Viníkem byl Virus hepatitidy A. Ale mohl to být také virus hepatitidy E – oba dva se přenášejí špinavýma rukama či neomytými potravinami. Kromě těchto hepatitid známe ještě jiné, které se přenášejí pouze krví či sexuálně Virové hepatitidy jsou různé, různé jsou i viry, které je způsobují. Společné však mají to, že jejich diagnostika musí respektovat skutečnost, že jsou to viry, a ne bakterie.

Jak vypadají viry http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm

Co jsou to vlastně viry? Viry jsou nebuněčné částečky, vedou se diskuse, zda jsou to vůbec živé organismy O původu virů je několik teorií, není ani jisté, že vznikly všechny stejným způsobem Stejně jako buněčné organismy se snaží o „zachování rodu“, potřebují k tomu ale buňku cizího organismu Kromě lidských virů existují i viry zvířecí, rostlinné a viry baktérií (takzvané bakteriofágy) Mezi viry nepatří priony – chyby v bílkovině. Přesto je však zvykem probírat je ve virologii.

Rozdělení virů Podle nukleové kyseliny rozdělujeme viry na DNA viry a RNA viry Podle počtu vláken DNA/RNA jednovláknové (ss) a dvouvláknové (ds), u jednovláknových se ještě rozlišuje, zda se jedná o "plus" vlákno nebo "mínus" vlákno. Podle přítomnosti virového obalu se jak DNA, tak i RNA viry dělí na obalené a neobalené. Dále se klasifikují do čeledí a rodů, jako bakterie či živočichové; zato druhové názvy se zpravidla nepoužívají

Virová částice – virion Virion není buňka. Viriony mají menší rozměry než většina buněk včetně bakteriálních: nejčastěji 20–300 nm Skladba virionu nukleokapsida nebo jádro a kapsida obal (u obalených virů) u některých odlišná, atypická skladba (VHB) Je-li virus právě přítomen v hostitelské buňce, jeho struktura a uspořádání je odlišná od viru vyskytujícího se ve vnějším prostředí

Nukleokapsida je přítomna u všech virů skládá se z nukleové kyseliny (DNA, RNA) a bílkovinné kapsidy kapsidy mohou mít helikoidální (šroubovicovou), kubickou či jinou symetrii. viry s kubickou symetrií tvoří tzv. pseudokrystaly – pravidelné útvary, přičemž jednotlivé viriony v nich jsou například tvaru pravidelného dvacetistěnu.

Lipoproteionový obal mají jej pouze obalené viry. je tvořen lipidickou dvojvrstvou, která pochází z hostitelské buňky (původně např. cytoplazmatická, jaderná membrána apod.), do které jsou včleněny virové proteiny v některých případech je obal připojen specifickou bílkovinou k jádru. obalené viry jsou méně odolné (hynou totiž při porušení obalu např. vyschnutím) Více o virech v bonusové části

Viry hepatitid

Viry hepatitid Existuje pět hlavních typů virových hepatitid VHA až VHE, které způsobují viry HAV až HEV. Každý patří do jiné skupiny, většina jsou RNA viry, ale virus hepatitidy B je DNA virus VHA a VHE (pomůcka: samohlásky) se přenášejí fekálně orální cestou (ruce), nepřecházejí do chronicity VHB, VHC a VHD (souhlásky ) – přenos krví, popř. sexuální (u VHC spíše nevýznamný), mohou přecházet do chronicity Kromě oněch pěti typů se občas hovoří i o dalších (viry hepatitidy G, GC, H apod.). Jejich zařazení a význam je však stále nejistý.

Přehled hepatitid Hepatitida Zařazení Přenos HAV Picornaviridae fekálně-orální HBV Zvláštní skupina DNA virů sexuální, krví HCV (a HGV) Flaviviridae krví HDV Delta agens – viroid HEV Příbuzný kalicivirům

Virus hepatitidy A http://www.epidemic.org/cgi-bin/hepcglossary.cgi?query=HepatitisA&caller=theFacts/viruses/viralReplication.html www.faqs.org/health/Sick-V2/Hepatitis.html.

Virus hepatitidy B www.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/hepb.html.

Virus hepatitidy B Pouhý prázdný HBsAg 22 nm Kompletní virion (Daneho tělísko) 42 nm HBsAg, uvnitř delta agens (VHD) 35 nm

Virus hepatitidy C http://www.pcswn.com/Hep%20C%20Awareness%20Month/cut%20model%20of%20Hepatitis%20C%20virus.gif

Virus hepatitidy D virology-online.com/viruses/HepatitisD.htm

Virus hepatitidy E http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm

Hepatitidy Jde o infekční záněty jater, lidově zvané žloutenky. Je ovšem nutno odlišit žloutenku jako přenosné virové onemocnění a žloutenku jako příznak, který je přítomen nejen při hepatitidě, ale i např. při obstrukci žlučových cest kameny Pacient má horečky, trávicí potíže, může být přítomno zežloutnutí skléry či kůže, změna barvy moče a stolice atd. Hepatitidy B, C a D mohou přecházet do chronicity, a někdy i být prekancerózou

Postižené orgány http://www.nursing.uiowa.edu/sites/LRS_equip_photos/Index-7.htm

Pacienti se žloutenkou http://www.gihealth.com/images/imgJaundiceBig.jpg medicine.ucsd.edu/Clinicalimg/skin-jaundice.html.

Klasickým zdravotnickým problémem je zejména hepatitida typu B přechází do chronicity, možnost cirhózy či karcinomu jater dříve možný přenos ve zdravotnictví, při dnešní úrovni zdravotnictví připadá v.úvahu jen sexuální přenos a (stejně jako u hepatitidy C) i. v. narkomanie screening hepatitidy B běžný v řadě situací (před operacemi, v těhotenství apod.)

Dva případy z hlášení KHS JMK (2008) Žena nar. 1985, BK, nezaměstnaná, PP 28. 4. svědění kůže, teplota, ikterus sklér, 2. 5. hospitalizace na KICH FN Brno, v anamnéze před půl rokem abortus s kyretáží a extrakce zubu. Žena nar. 1986, BM, nezaměstnaná. PP 31. 3. bolesti pod pravým žeberním obloukem, svědění kůže, nevolnost. 15. 4. ikterus kůže a sklér, 14. 4. hospitalizace na KICH FN Brno. V anamnéze i. v. pervitin PP = první příznaky

www.pegasys.com/hcp/efficacy-hepatitis-b.aspx

www.pegasys.com/hcp/efficacy-hepatitis-b.aspx

pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm Nahoře: pacient se žloutenkou při hepatitidě B. Vpravo: žena z thajského uprchlického tábora, která má hepatom po hepatitidě, později na nemoc zemřela

Změny v játrech u VHB pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm

Rizikové faktory hepatitidy B pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm

Vývoj počtu případů v USA pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm

Prevence a léčba hepatitid Očkování proti hepatitidě B je nyní součástí normálního očkovacího kalendáře Očkování proti hepatitidě A je dostupné a doporučené např. i při cestách do jižní Evropy či severní Afriky. Možné i současné očkování proti hepatitidě A + B U některých hepatitid se používá léčba pomocí interferonů Jinak se používají hepatoprotektiva (látky chránící játra) a jiná podpůrná terapie

HIV

Virus HIV Patří mezi tzv. retroviry, které disponují reverzní transkriptázou (enzym pro přepis RNA do DNA) Virus HIV existuje ve dvou typech s tím, že většinu infekcí způsobuje první typ viru Přenáší se krví, pohlavní cestou a také z matky na dítě Existuje řada léků proti viru HIV, avšak jejich účinnost je omezená.

Retrovirus  http://fc09.deviantart.net/fs34/f/2008/301/4/8/Retrovirus_by_Velica.jpg

Virus HIV – onemocnění Virus postihuje především buněčnou imunitu Po nespecifické primární infekci nastává dlouhé období, kdy se „nic neděje“. Poté se postupně vyvíjí generalizovaná lymfadenopatie, objevují se postupně oportunní infekce a při určitém stupni infekce se již hovoří o rozvinutém onemocnění AIDS V případě AIDS nedominují vlastní příznaky. Hlavním projevem nemoci je nápadný výskyt oportunních infekcí (toxoplasmóza, pneumocystóza, různé mykózy aj.) a nádorů

http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm

Diagnostika hepatitid a HIV infekce

A nyní již diagnostika. Nejprve opakování Cílem mikrobiologických metod je zpravidla detekce patogena, popř. určení jeho citlivosti na antimikrobiální látky (ale u virů zatím většinou ne) Přímé metody detekce celého mikroba (jako morfologické či fyziologické jednotky) detekce jeho části (antigenu, DNA) detekce jeho produktu (například toxinu) Nepřímé metody: detekce protilátek (pozitivita = kontakt s mikrobem v minulosti – týdny / měsíce / roky)

Přehled metod – a které využijeme v tématu J10: Přímé metody (práce se vzorkem či kmenem) Mikroskopie – u virů obtížná Kultivace – u virů obtížná Biochemické metody – u virů se nepoužívají Průkaz antigenu (pomocí protilátky) Pokus na zvířeti (izolace, průkaz toxicity) Průkaz nukleové kyseliny Nepřímé metody (práce se vzorkem séra) Průkaz protilátek (pomocí antigenu)

Přímý průkaz virů Kultivace  izolace (virus se často nepomnoží, jen uchová živý). Vyžaduje živé buňky. Blíže v příští části. Mikroskopie: elektronoptická spíše pro výzkum než pro běžnou diagnostiku, ale i optická k průkazu něčeho, co viry dělají in vivo či in vitro (inkluze, cytopatický efekt) Biochemická identifikace nepadá v úvahu Pokus na zvířeti zde splývá s izolací viru Průkaz DNA – u virů > u bakterií Průkaz AG ve vzorku – u virů velmi běžný

Nepřímý průkaz virů Používá se hlavně KFR, různé typy neutralizací (HIT, VNT) a v poslední době především reakce se značenými složkami (hlavně ELISA) Pozor! Ne vše, kde se jako vzorek použije sérum, je nepřímý průkaz! U systémových viróz je často agens (nebo jen jeho antigen) v séru přítomno, a pak se dá sérum použít i pro přímý průkaz

Diagnostika hepatitid A, C, D, E HAV. Stanovujeme metodou ELISA anti-HAV IgM s IgG, nebo IgM a celkové protilátky HCV. Rovněž stanovujeme IgM a IgG protilátky metodou ELISA, dále se používá PCR HDV. Prokazuje se delta antigen (HDAg), protilátky (anti-HD) či virová RNA PCR HEV. Opět průkaz IgM a IgG protilátek metodou ELISA, ve výzkumu je PCR

HAV  www.wallpaper.cz

Vývoj žloutenky typu A www-micro.msb.le.ac.uk/3035/HAV.html.

Zvláštnosti diagnostiky HBV Ve středu virionu hepatitidy B je nukleokapsida, kde je umístěna DNA a bílkoviny. Významné jsou dvě dřeňové bílkoviny, které mají povahu antigenů: HBcAg a HBeAg Kromě toho má virus obal, který je zčásti tvořen dalším antigenem: HBsAg HBsAg je nadprodukován, takže v krvi kolují i prázdné obaly Do prázdného HBsAg může proniknout také delta agens – původce hepatitidy D

Delta agens Delta agens je viroid, částice s neurčitou virologickou klasifikací Delta agens může infikovat člověka buďto zároveň s virem hepatitidy B (koinfekce), nebo následně po takové infekci (superinfekce) Přítomnost delta agens podstatně zhoršuje prognózu virové hepatitidy

Kompletní viriony a prázdné HBsAg www.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/hepb.html.

Diagnostika HBV HBV má tři pro diagnostiku významné antigeny. Jen dva z nich však nalézáme v.séru: HBsAg a HBeAg. HBsAg se tvoří v nadbytku, takže je ho vždy v.séru hodně, proto se hodí pro screening Protilátky naopak můžeme stanovovat proti všem třem z nich: anti-HBs, anti-HBe i anti-HBc. Diagnostiku případně doplní PCR, průkaz jaterních enzymů aj. Z kombinace vyšetření plyne interpretace

pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm

pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm

Diagnostika viru HIV Prokazují se protilátky proti obalovým glykoproteinům pomocí ELISA testů. Pokud výsledek vyjde jako pozitivní, pošle se vzorek séra do referenční laboratoře, která výsledek ověří (konfirmuje) další reakcí ELISA a Western blottem. Do výsledků konfirmace je výsledek hodnocen jako „reaktivní“, nikoli jako „pozitivní“ Přímý průkaz lze provádět pomocí PCR. Izolace viru je dnes již možná, ale velmi náročná a běžně se neprovádí

Praktické diagnostické přístupy

Praktická diagnostika hepatitid a HIV infekce: ELISA Ačkoli některé reakce ELISA slouží k průkazu antigenu a jiné k průkazu protilátek, praktický přístup je obdobný. Počítání cut off: průměr důlků cut off, nebo průměr negativních kontrol + konstanta Často cut off 10 ± % = hraniční hodnoty V některých případech, zvláště u diagnostiky VHA nevyšetřujeme protilátky IgM a IgG, nýbrž IgM a celkové protilátky. Je jasné, že negativní IgM a pozitivní celkové protilátky prakticky značí přítomnost protilátek IgG.

Praktická diagnostika hepatitid a HIV infekce: PCR PCR se používá hlavně u diagnostiky HCV, případně HIV Postup je stejný, jako u jiných PCR

Konec >>> Lambda fág >>> http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Cromovibac/cromovibac.htm

Více k virům Množení (replikace) virů probíhá buď v jádře (většinou u DNA virů), nebo cytoplasmě (většinou u RNA virů) hostitelské buňky. před replikací se virus musí zbavit svých bílkovinných obalů vlastní průběh replikace závisí na konkrétním typu daného viru (RNA/DNA, jednovláknové – ss/ dvouvláknové – ds).

Jednotlivé možnosti replikace U většiny DNA virů je DNA-polymerázami dotvořeno vždy komplementární vlákno U hepadnavirů (VHB) je DNA přepisována do RNA, podle té pak reverzní transkriptázou vzniká zase DNA U RNA virů se využívají RNA polymerázy U retrovirů (HIV) se podle RNA tvoří reverzní transkriptázou DNA, která je přepisována buněčnou RNA-polymerázou

Tvorba virových bílkovin je nutná k tomu, aby se virus po replikaci mohl z buňky uvolnit a šířit se dál. vlastní tvorba bílkovin opět probíhá různě podle toho, o který typ viru se jedná v každém případě virus částečně využívá proteosyntetický aparát hostitelské buňky.

Jednotlivé možnosti tvorby bílkovin +ss RNA: je možná přímá translace –ss RNA: musí se dotvořit + vlákno ds RNA: z – vlákna se dotváří + vlákno retroviry: reverzní transkriptázou se vytvoří DNA a pak už pracují buněčné polymerázy ds DNA: zpravidla se podle – vlákna tvoří + vlákno RNA ss DNA: dotvoří se druhé vlákno a pak je to už stejné jako u ds DNA

Viry závislé na jiných virech Zvláštností jsou některé viry, které nemohou existovat bez spoluúčasti jiných virů Adenoasociované viry (AAV) patří mezi parvoviry. Replikace je možná pouze za přítomnosti pomocného viru (adenoviru) Virus hepatitidy D – delta agens – je viroid. Je to nekompletní částice, která je schopna přežití pouze v obalu viru hepatitidy B (tvořeném hlavně HBsAg).

Viry a vnější prostředí, desinfekce některé viry jsou hodně citlivé (např. HIV) jiné jsou zato mnohem odolnější než bakterie (třeba rhinoviry). mnohé desinfekční prostředky, které působí na baktérie, nepůsobí na viry nebo jsou nutné vyšší koncentrace; týká se to zejména neobalených virů. Účinné bývají jodové preparáty a peroxidy. velmi odolné vůči desinfekci i vysokým teplotám jsou priony

Viry jako původci lidských nemocí Dítě napadené cytomegalovirem

Možnosti přenosu virů Cesty přenosu jsou u virů rozmanité, jsou ovšem prakticky stejné, jako u bakterií máme viry přenosné kapénkovou infekcí, fekálně-orální cestou, sexuálním přenosem, přenašečem (klíště, komár) či krví (injekce). u většiny virů je také možný „vertikální“ přenos, to jest z matky na plod.

Faktory patogenity Na rozdíl od bakterií se u virů často nerozlišují jednotlivé patogenní struktury, spíše se virus jako celek považuje za patogenní částici. Tomu odpovídá i boj s infekcí, kdy protilátky často celou virovou aktivitu neutralizují. S tím také souvisí větší význam neutralizačních metod v diagnostice.

Průběh virové infekce u virů záněty probíhají jinak než u baktérií souvisí to zejména s nitrobuněčným parasitismem virů zejména je menší účast granulocytů, větší účast lymfocytů, a význam buněčné imunity také složky nespecifické humorální imunity jsou odlišné (zejména interferony).

Latentní infekce hostitelská buňka sice umožní vniknutí viru do buňky neumožní však jeho množení a uvolnění z buňky zato umožní jeho přežívání v buňce nebo dokonce včlenění do chromozomu. v některých případech může dojít později k aktivaci této latentní (skryté) infekce, takže infekce vlastně znovu vypukne typické je to u některých herpesvirů.

Viry a nádory Některé viry mají zřejmě vliv na vznik některých nádorů, zejména EB virus (původce infekční mononukleózy – podílí se na vzniku Burkittova lymfomu) a HHV8 spolu s HIV (vznik Kaposiho sarkomu), či lidský papilomavirus (HPV) – vliv na rakovinu děložního čípku Příčinou je to, že virový promotor v těchto případech může aktivovat expresi onkogenů lidských buněk, která by jinak byla potlačena (neprojevila by se).

Boj s viry I – antivirotika Používají se jen u některých virů Zpravidla jen dílčí význam v terapii Mohou být celková či lokální (někdy i tatáž látka, např. acyklovir – HERPESIN) Testování citlivosti in vitro zatím spíše experimentální Z nejznámějších: acyklovir, famciklovir, ganciklovir (herpesviry), amantadin, rimantadin, oseltamivir, zanamivir (chřipka), azidotymidin, PMPA (virus HIV)

Boj s viry II – imunoterapie Používá se možností pasivní imunizace (protilátky) i aktivní imunizace (očkování) Z očkování pravidelného kalendáře: Živé oslabené viry: spalničky, zarděnky, příušnice Neživé vakcíny: virová hepatitida B, dětská obrna (Salk) Z ostatních vakcín: vzteklina (profylaxe, ne prevence), klíšťová encefalitida, VHA atd. Z pasivní např. protilátky proti VZV, HBV

Kontrolní otázky 1. Jaký je význam "celkových protilátek proti HAV"? Kdy uvažujeme o infekci VHA? 2. Co znamená v sérologii slovo „konfirmace“? 3. Jakým způsobem probíhá konfirmace při diagnostice HIV? 4. Které jsou typické markery infekce hepatitidou B? 5. Která skupina osob je vysoce riziková z hlediska nákazy HCV? 6. Po jaké době po rizikové situaci (například kontakt s krví nebo sexuální styk bez kondomu) má smysl vyšetřit protilátky proti HIV? 7. Kde se skrývá viroid? 8. Které jsou typické metody pro diagnostiku infekce HCV? 9. Jaké jsou možnosti určování cut off u reakce ELISA? 10. Které typy hepatitid se přenášejí fekálně-orální cestou?

VIRY II

Obsah této části prezentace Viry chřipky Další respirační viry Mykoplasmata Virus klíšťové encefalitidy Některé vlastnosti virů důležité pro diagnostiku Přehled virologické diagnostiky Mikroskopie ve virologii. Izolace virů Nepřímé metody ve virologii Kontrolní otázky

Příběh Pan Plicník ležel povadle už více než týden v nemocnici pro dlouhodobé dýchací obtíže. Shlukla se kolem něj skupinka mediků. Snaživě ho lechtali svými fonendoskopy a nesmělými prsty zkoušeli poklep. Nenašli však žádný patologický nález. Vtom se přihlásila studentka Pilňoušková. „Pacient má suchý kašel, fyzikální vyšetření nic neprokázalo. Nemohlo by jít o atypickou pneumonii?“ Asistent zazářil: „Výborně, no aspoň někdo že na to přišel!“

Atypické pneumonie Pojem se nyní považuje za zastaralý, nicméně se ho přidržíme pro popsání pneumonií, které se vyznačují pomalejším nástupem, spíše neproduktivním kašlem a častou absencí klasických fyzikálních příznaků (ale RTG nález je přítomen) nebývají způsobovány klasickými kultivovatelnými bakteriemi (Streptococcus pneumoniae) původci jsou respirační viry (vizte dále) atypické bakterie: Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia (Chlamydophila) pneumoniae, Legionella sp. V případě bakteriálních původců je možná antibiotická léčba (doxycyklin, makrolidy)

V rámci této prezentace jsou zmíněny viry respirační viry chřipky A a B viry parachřipky RS viry adenoviry Mycoplasma pneumoniae – není virus, ale diagnostikuje se virologickými metodami virus klíšťové encefalitidy

Viry chřipky

Chřipka Chřipka je onemocnění celého těla, ale především dolních cest dýchacích. K obrazu chřipky nepatří rýma ani bolesti v krku, ale suchý kašel, vysoké horečky, schvácenost a bolesti svalů. Začíná často velice prudce. Nebezpečná bývá chřipka u imunosuprimovaných (především delší trvání), těhotných, starších osob. Na druhou stranu, některé subtypy postihují více mladé, zdravé lidi paradoxně právě kvůli příliš dobré imunitě. Uplatňují se zde tzv. cytokinové bouře jako vlastní příčina zdravotních komplikací Existuje chřipka A, B a C. Za většinu epidemií ovšem může virus chřipky A

Virus chřipky A http://micro.magnet.fsu.edu/cells/viruses/influenzavirus.html

Influenzavirus A – antigeny Z vlastností viru chřipky je nejdůležitější antigenní proměnlivost. U viru chřipky se rozeznává 15 podtypů podle hemaglutininového antigenu (H) a 9 podtypů podle různé neuraminidázy (N). Je možný antigenní posun – drift, tedy přírodní mutace genů pro kódování antigenních determinant, nepřináší zcela nový typ viru Je také možná antigenní výměna – shift: dojde k přeskládání (reassortment) například mezi ptačím a lidským kmenem viru, takže vznikne zcela nový typ viru. Je možný jen u chřipky A, protože ostatní typy jsou čistě lidské Shift je umožněn segmentovaným genomem

Virus chřipky gustavorinaldi.blog.lastampa.it

Chřipkové pandemie Jak se viry mění, občas se objeví nová varianta a nikdo proti ní není chráněn. Takový virus je pak schopen vyvolávat epidemické výskyty, epidemie či dokonce pandemie na velkých územích. Samozřejmě, konkrétní průběh nelze nikdy předpovědět dopředu. Viry schopné epidemického výskytu v lidské populaci musí mít nejen zvýšenou virulenci, ale také schopnost přenosu z člověka na člověka. U ptačích virů taková schopnost zpravidla chybí. Jako „mixážní nádoba“ obvykle (ne ale nutně) slouží prasata. Ptačí faktory virulence se tedy stávají nebezpečnými až po promíchání či rekombinaci s částmi savčích virů.

Chřipkové pandemie 2 Během 1. světové války zahynulo mnoho lidí na tzv. španělskou chřipku Během dalších desetiletí proběhlo několik relativně menších epidemií (Hongkongská chřipka, Singapurská chřipka) Nedávná epidemie („prasečí chřipka“) byla způsobena virem patřícím do skupiny A:H1N1. Samotný pojem „A:H1N1“ neznačí nic nového, ale konkrétní struktura viru byla zvláštní, protože virus nesl části lidského, prasečího i ptačího původu

Chřipka – prevence, profylaxe, léčba Prevence je možná očkováním, které je doporučeno hlavně oslabeným osobám. Očkování chrání jen před viry aktuálně přítomnými v populaci, nikoli před novými subtypy viru. K profylaxi a léčbě lze použít některá antivirotika, jednak inhibitory proteinu M2 (amantadin a rimantadin, některé kmeny jsou již na ně rezistentní), jednak inhibitory neuraminidázy (zanamivir a oseltamivir, známé pod firemními názvy TAMIFLU a RELENZA). Antivirotika je třeba užívat jen ve zdůvodněných případech. Zbytečné „preventivní“ užívání kvůli panice může vést vývoji rezistence.

Virus chřipky www.ontariogenomics.ca/education/episode6.asp http://www.bio-pro.de/en/region/rhein/magazin/01112/index.html

Chřipka – životní cyklus http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/influenza.php

In flew Enza  Z knihy „A practical guide to clinical bacteriology“, Pattison JR et al., Wiley, London 1995

Další respirační viry

Viry parachřipky Jsou to paramyxoviry, blízce příbuzné viru příušnic (mumps) a vzdáleněji i viru spalniček (osýpok) Na rozdíl od pravé chřipky dělají často i katary horních cest dýchacích. Chřipce podobný kašel však může být též, většinou však (zvlášť u dospělých) bez horečky. Diagnostika: KFR, HIT, ELISA; jsou zkřížené reakce. Je možný i přímý průkaz ve výplachu z.nosohltanu izolací na buněčné kultuře.

RS virus (respirační syncyciální virus, pneumovirus) Je vzdáleně příbuzný virům parachřipek RS-virus je významným patogenem dolních cest dýchacích v prvním půlroce života Jak napovídá název, způsobují splývání nakažených buněk (syncycia – soubuní) Diagnostika – ELISA, přímo buněčné kultury Metapneumovirus je novější virus, který je s pneumovirem příbuzný

Adenoviry – Neobalené DNA viry Poprvé byly izolovány 1953 z vyříznuté adenoidní vegetace (nosní mandle) Zahrnuje viry lidské, zvířecí a ptačí Jsou středně velké (80 nm), neobalené, symetrie kapsidy je kubická. Mají tvar dokonale pravidelného dvacetistěnu. Kapsida je složena z.240 hexonů a 12 vrcholových pentonů. Je známo 47 serotypů adenovirů, které mohou být patogenní pro člověka. Ty se mohou lišit příznaky i možností diagnostiky

Adenovirus http://www.tulane.edu/~dmsander/Big_Virology/BVDNAadeno.html

Lidské adenoviry Mohou vyvolávat rýmy (nádchy), záněty hltanu, záněty spojivek (od lehčích po závažné) Typy 40 a 41 (lišící se také tím, že se nedají kultivovat) způsobují průjmy (hnačky) malých dětí Jeden typ také může způsobovat zánět močového měchýře s krvácením Diagnostika může být kultivační (na buněčných kulturách) a serologická (komplementfixace) Cílená léčba není možná

http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/emimages.html Adenovirus

Adenoviry http://www.tulane.edu/~dmsander/Big_Virology/BVDNAadeno.html

Mykoplasmata

Mykoplasmata http://www.unmc.edu/dept/biochemistry

Mykoplasmata zvláštní skupina bakterií – Mollicutes – "ty s měkkou kůží" nemají buněčnou stěnu nelze stanovit jejich tvar, který může být kulatý, oválný či vláknitý u člověka jsou významné rody Mycoplasma a Ureaplasma nejmenší organismy, které ke svému růstu nepotřebují cizí buňku několikrát menší než běžné bakterie

www.unc.edu www.invivogen.comv www.rowland.harvard.edu

Mycoplasma pneumoniae původcem tzv. atypických pneumonií. mohou nastat i mimoplicní komplikace (srdeční, nervové a jiné). často naopak jen jako rýma nebo úplně bez příznaků přenos vzduchem

Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum důležití původci pohlavně přenosných nákaz záněty pochvy, močové trubice aj. na druhou stranu jsou často přítomny v uretře zdravých osob Další urogenitální mykoplasmata: Mycoplasma genitalium: také na pohlavních orgánech, význam nejasný Mycoplasma penetrans: u nemocných AIDS jako oportunní infekce

webdb.dmsc.moph.go.th

Mykoplasmata webdb.dmsc.moph.go.th www.newbugs.info

Mykoplasmata: diagnostika a léčba Kultivace na nebuněčných, avšak nicméně speciálních médiích KFR, ELISA aj. Obvykle zároveň se serologií respiračních virů Nelze použít antibiotika, působící na buněčnou stěnu Účinné jsou tetracykliny, u dětí je nutno použít makrolidy (tj. erytromycin a spol.) U M. pneumoniae se zkouší očkování – ve stádiu výzkumů.

Virus klíšťové encefalitidy

Virus klíšťové encefalitidy Vírus kliešťovej encefalitídy RNA virus, patří mezi flaviviry Klíšťová encefalitida sice postihuje často děti, závažné příznaky má však spíše u dospělých. Přesto se dospělí málokdy nechají očkovat. V.první fázi připomíná chřipku, ve druhé příznaky meningeální či mozkové. Smrtnost (letalita) infekce je 1–5 %. Jde o typický arbovirus, zdrojem jsou hlodavci Diagnostika je nejčastěji nepřímý průkaz – KFR, HIT, ELISA. Lze použít také přímý průkaz izolací viru na sajících myšatech, případně PCR

Virus klíšťové encefalitidy http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/virus01.htm

Některé vlastnosti virů důležité pro diagnostiku

Z vlastností virů Víme již, že viry jsou nebuněčné částice, obsahující DNA či RNA v nukleokapsidě, a případně ještě obsahující virový obal Součástí tohoto obalu může být látka, která in vitro shlukuje červené krvinky. Tohoto jevu jsme ostatně už využili v praktiku J08 v.hemaglutinačně inhibičním testu. Podobná je také schopnost hemadsorpce Z dalších vlastností: Virus potřebuje cizí buňky. Takové nalezne např. ve buněčné kultuře nebo ve strukturách oplodněného vejce s kuřecím zárodkem

Přehled virologické diagnostiky

Virologická diagnostika Přímý průkaz Mikroskopie: elektronoptická, optická jen k průkazu něčeho, co viry dělají in vivo či in vitro (inkluze, cytopatický efekt) Kultivace  izolace Vyžaduje živé buňky. Biochemická identifikace nepadá v úvahu Pokus na zvířeti zde splývá s izolací viru Průkaz DNA – u virů > u bakterií Průkaz Ag ve vzorku – velmi běžný Nepřímý průkaz – obvykle základem veškeré diagnostiky virů

Chřipka – diagnostika Diagnostika má epidemiologický význam (důkaz, že epidemii působí opravdu chřipka) Přímý průkaz chřipky (výplach z nosohltanu nebo výtěr do speciálního transportního média) průkazem virového antigenu izolace v amniové dutině (virus se pak prokazuje Hirstovým testem) izolace na buňkách opičích ledvin průkaz virové RNA pomocí PCR Nepřímý průkaz chřipky klasické vyšetření – párová séra, KFR, HIT ELISA – IgM, IgA

Mikroskopie ve virologii. Izolace virů

Mikroskopie ve virologii Elektronová mikroskopie je vhodná k.pozorování většiny virů. Je však velmi nákladná a není vždy dostupná (= ne k rutinní diagnostice) Optická mikroskopie se dá použít K pozorování cytopatických efektů in vitro (řada různých virů) K pozorování buněčných inkluzí in vivo (Negriho tělíska u vztekliny) – spíše v rámci histologie než mikrobiologie K pozorování velikých virů (poxviry) – výjimečně, pro praxi se nehodí

Izolace virů Zvíře se používá dnes již méně často. Klasickým zvířetem je sající myše. Vaječný zárodek je klasickou metodou Amniová dutina Allantois Žloutkový vak Chorioalantoidní membrána (pouze zde někdy pozorovatelný výsledek – tzv. poky; v ostatních případech není výsledek izolace na zárodku viditelný) Buněčné kultury (kultury „nesmrtelných“ zvířecích či lidských buněk – embryonálních či nádorových): například LEP, HeLa, opičí ledviny a různé jiné. Některé (jen některé!) viry dělají na buněčné kultuře cytopatický efekt (CPE)

Oplodněné vejce a jeho části http://www.kidfarm.net/chicken/embryo.jpg

Ještě jedno schéma oplodněného vejce SH – skořápková (papírová) membrána AB – bílek http://www.scielo.cl/fbpe/img/bres/v38n4/fig02.gif AM – amniový vak, YS – žloutkový vak, AL – allantois CH – chorioallantoidní membrána (CAM)

Izolace virů a podobných agens na vejci Amniová dutina, obklopující zárodek se používá často, např. u virů chřipky Allantois, tedy odpadní váček, je zejména u starších embryí snadno dosažitelnou strukturou. Je však málo výživný Žloutkový vak slouží např. k pěstování chlamydií (což jsou bakterie, ale vlastnostmi značně podobné virům) Chorioalantoidní membrána slouží k.pěstování zejména poxvirů a herpesvirů Při výrobě očkovací látky se virus pěstuje na allantois (což je možné až po několika pasážích v amniu)

Izolace viru na oplodněném vejci prakticky Ovoskop V době, kdy svět přetéká technicky komplikovanými přístroji, kterými rozumí stále méně techniků, zůstává úžasným klasickým zařízením ovoskop. Skládá se z.dřevěné bedničky, žárovky a posuvného prkénka s dvěma otvory. Jeden je kulatý k umístění vejce nastojato Druhý je oválný k umístění vejce naležato

Aplikace viru do amniové dutiny: jak to provést Vejce prosviťte v ovoskopu a naznačte tužkou okraj vzduchové bubliny Odřízněte skořápku nad vzduchovou bublinou Na papírovou blanku kápněte alkohol Vejce opět prosviťte v ovoskopu a vyznačte pozici zárodku, resp. jeho oka Jehlou se jakoby snažte vypíchnout oko kuřecímu zárodku (ono stejně uteče) – buď přímo v.ovoskopu, nebo případně mimo něj Aplikujte virus Vejce opět zavíčkujte a inkubujte několik týdnů

Jak prokážu virus, když ho není nijak vidět? Bakterie při kultivaci tvoří viditelné kolonie, nebo aspoň kalí bujón. Naproti tomu, jen někdy vidíme výsledek izolace viru (CPE, poky), mnohem častěji výsledek viditelný není Izolovaný virus tedy musíme nějak prokázat U virů z amniové tekutiny se používá Hirstův test – průkaz schopnosti viru shlukovat krvinky. V případě pozitivity se zjišťuje, které specifické protilátky jsou schopny shlukování zabránit (jde tedy o HIT použitý zde k přímému průkazu) U virů z buněčných kultur (např. viru chřipky z kultury opičích ledvin) se testuje schopnost virové hemadsorpce

Hirstův test prakticky F = fyziolog. roztok V = virus (amniová tekutina) E = erytrocyty 0.2 ml F ----- 0.2 ml V 0.2 ml míchej pipetuj 0.2 ml E do desinfekce

Cytopatický efekt (CPE) na buněčné kultuře Jen zřídka se cytopatický efekt viru na buňku projeví podstatnou změnou metabolismu, která by se pak při přidání indikátoru projevila barevnou změnou viditelnou makroskopicky (jak bychom viděli u virus neutralizačního testu) Častěji CPE pozorujeme v mikroskopu: zakulacení buněk ztráta desmosomů mezi buňkami ztráta uspořádání jedním směrem celkově nastává „místo řádu chaos“ Mnohé viry ovšem na buněčných kulturách nedělají vůbec žádný cytopatický efekt

Tento obrázek ještě uvidíte jednou… http://cmir.mgh.harvard.edu/cellbio/cellculture.php?menuID_=122 www.herpesdiagnosis.com/diagnose.html Tento obrázek ještě uvidíte jednou… (HSV je virus prostého oparu – HSV 1 způsobuje zpravidla herpes labialis, HSV 2 herpes genitalis)

Praktické pozorování buněčných kultur Strčte si do mikroskopu celé zkumavky tak jak jsou, snažte se zaostřit na vnitřní stěnu. Možná uvidíte buněčné kultury, v některých možná i s.cytopatickým efektem Zkušené oko rozezná různé buněčné kultury a případně také různé typy cytopatických efektů

Takže tady CPE je… …kdežto zde není http://cmir.mgh.harvard.edu/cellbio/cellculture.php?menuID_=122 www.herpesdiagnosis.com/diagnose.html (HSV je virus prostého oparu – HSV 1 způsobuje zpravidla herpes labialis, HSV 2 herpes genitalis)

Techniky shell-vials Jde o techniky urychlené kultivace. Inokulum se centrifugací vmasíruje do buněčné kultury narostlé na kulatém krycím sklíčku Pomnožený virus se dokazuje pomocí imunofluorescence monoklonálními protilátkami Celý postup je hotov do 24 h po přijetí vzorku (zatímco klasická kultivace trvá několik týdnů)

Nepřímé metody ve virologii

KFR u respiračních virů – příklad Cílem je určit, který z šesti testovaných původců je zodpovědný za momentální respirační potíže našeho pacienta Pozitivní je nepřítomnost hemolýzy (=  sedimentace krvinek na dno) Negativní je hemolýza („malinová limonáda“) Titr je nejvyšší ředění, kde je ještě reakce pozitivní (= kde krvinky sedají na dno) Čtyřnásobný vzestup/pokles titru se považuje za signifikantní (při použití párových sér)

HIT – klíšťová encefalitida (příklad) Vedle KFR je HIT jednou z klasických metod průkazu tohoto viru. Pozitivní je zábrana virového shlukování krvinek (= sedimentace krvinek na dno) Negativní je shlukování krvinek (bramboroid či bramborák, jak je komu libo) Titr je nejvyšší ředění, kde je ještě reakce pozitivní (tedy kde krvinky sedají na dno) Čtyřnásobný vzestup/pokles titru se považuje za signifikantní při použití párových sér

Konec http://www.tulane.edu/~dmsander/Big_Virology/BVDNAadeno.html

Kontrolní otázky 1. Jak se ve virologii používá elektronová a optická mikroskopie? 2. Co znamenají termíny „buněčná kultura“ a „cytopatický efekt“? 3. Které části oplodněného vejce se využívají k pěstování virů? 4. Proč se v diagnostice virů někdy užívají pokusná zvířata? 5. Jaké vzorky a metody se používají při virologické diagnostice chřipky? 6. Které metody průkazu virů vyžadují odběr dvou vzorků a jaký je ideální odstup mezi prvním a druhým odběrem? 7. Na čem jsou založeny techniky shells-vials? 8. Které jsou typické metody nepřímého průkazu virů? 9. Co je zač Mycoplasma pneumoniae? 10. Co znamená zkratka „RS virus“?