MOŽNOSTI UMĚLÉ INDUKCE POLYPLOIDŮ U VYBRANÝCH PODNOŽÍ OVOCNÝCH DRUHŮ Připravila: Bc. Petra Pavelková v Lednici, dne 25. 4. 2013 Diplomová práce MOŽNOSTI UMĚLÉ INDUKCE POLYPLOIDŮ U VYBRANÝCH PODNOŽÍ OVOCNÝCH DRUHŮ Vedoucí práce Ing. Tomáš Nečas, Ph.D.

Polyploidní šlechtění ÚVOD Polyploidní šlechtění Umělé vyvolávání genomových mutací, při kterých dochází k získání genotypu s více nežli dvojnásobným počtem haploidní sady chromozómů, tedy s troj a více násobky základního chromozomového čísla.

ÚVOD Získání druhů s novými vlastnostmi: Zejména z morfologického a fyziologického hlediska → jeden z významných způsobů získávání genetické variability užitkových plodin i okrasných rostlin. Mutanti vylepšují vlastnosti kulturních odrůd, např. lepším potravinářským a krmivářským aspektem, nebo zvýšenou odolností vůči nízkým teplotám, suchu, či patogenům.

POLYPLOIDNÍ ROSTLINY - ZMĚNY Zvětšení velikosti buněk, a často tak i celé rostliny, tzv. gigantismus. S těmito jevy je spojeno mnoho fyziologických a biochemických změn, např.: zvýšení obsahu vody v buňkách, snížení osmotického tlaku, změna obsahu různých látek - bílkoviny, chlorofyl, růstové regulátory, vitamíny atp.

SPONTÁNNÍ POLYPLOIDIE Významná z hlediska evolučního. V přírodě běžně - ve velkých nadmořských výškách, v severnějších zeměpis. šířkách a ve vzdálenějších oblastech od základního centra vývoje čeledí → přizpůsobení podmínkám. Většinou allopolyploidi. 30 až 35 % krytosemenných a přibližně 70 % travních druhů je polyploidních.

INDUKCE POLYPLOIDIE Chemomutageny, ozařováním, působením fyzikálních faktorů – tepelné šoky. Nejčastěji se využívá alkaloid kolchicin, oryzalin, trifluralin a oxid dusný. Tyto polyploidizační činidla potlačují funkci dělícího vřeténka → inhibují rozestupování dceřiných chromozómů k pólům, vzniká buňka se zdvojeným počtem chromozómů. Fyzikální faktory: nízké a vysoké teploty, teplotní šoky, ozařování.

CÍL PRÁCE Zpracovat literární přehled o využití polyploidie u ovocných plodin. Popsat metody a postupy při polyploidním šlechtění. Provést analýzu rostlinného materiálu ze založeného pokusu s rostlinami ovlivněnými kolchicinem za pomoci mikroskopických technik.

CÍL PRÁCE Zhodnotit rozdíly ve velikosti průduchů ovlivněných rostlin oproti kontrolní variantě. Porovnat výsledky a statisticky je zpracovat. Zjistit dopad kolchicinu na vybrané podnože ovocných dřevin. Srovnat výsledky s hodnotami z prvních let experimentu. Zhodnotit úspěšnost pokusu s možným získáním polyploidních rostlin, které by se v budoucnu mohly použít k dalšímu šlechtění.

METODIKA Na pokus byly použity semena ovocných druhů: Pyrus betulaefolia Bunge., Pyrus communis L., Malus domestica Borkh., Cydonia oblonga Mill.

METODIKA Založení a průběh pokusu: Semena máčena 24 hodin ve vlažné vodě o teplotě 22 ̊C. Poté máčena 24 hodin v roztoku kolchicinu o 0,1% koncentraci. Následně uložena do truhlíku a připravena ke stratifikaci při 5 ̊C do konce dubna. Po skončení stratifikace byly přesunuty do větraného skleníku.

METODIKA Na jaře po vyklíčení, ve fázi dvou pravých lístků byly semenáčky přepichovány do sadbovačů a provedla se zálivka. Po 14 dnech zakořenily a byly ošetřeny roztokem kolchicinu o koncentraci 0,2 %. Aplikace se prováděla rosením růstových vrcholů s opakováním po 3 dnech. V polovině června přesazení rostlin do kontejnerů, přihnojení a umístění do sadu.

METODIKA Měření a vyhodnocení Na základě morfologických odlišností se vybralo 30 ovlivněných rostlin z každého rostlinného druhu, z nichž se odebraly vzorky plně vyvinutých listů a udělal se preparát. Taktéž i z 30 kontrolních rostlin všech druhů. Na každém listu bylo změřeno 15 průduchů. To samé se provedlo i v roce 2012, ale tentokrát se měřili všechny ovlivněné rostliny.

METODIKA Z naměřených hodnot byly vypočteny průměrné velikosti průduchů u jednotlivých rostlin. Zpracovala se statistika. Průkaznost rozdílů oproti kontrolním rostlinám se testovala analýzou rozptylu na hladině významnosti 0,95 %.

VÝSLEDKY Celkem bylo zhodnoceno 255 ks ovlivněných rostlin a k tomu ještě 30 ks kontrolních rostlin od každého tohoto druhu, tzn. celkem 120 ks. Byly vybrány kandidátní rostliny s největšími průduchy →nejvyšší pravděpodobnost navození polyploidie, a tudíž jsou nejzajímavější z hlediska dalšího využití ve šlechtění.

VÝSLEDKY – kandidátní rostliny Pyrus betulaefolia Bunge. 1/Bet = 41 µm; 72/Bet = 38,16 µm; 80/Bet = 38,16 µm; 63/Bet = 38 µm. Pyrus communis L. 42/H = 42,1 µm; 6/H = 40 µm; 41/H = 39,5 µm; 10/H = 39,3 µm. Malus domestica Borkh. 49/J = 34,6 µm; 48/J = 34,1 µm; 20/J = 32,3 µm; 46/J = 32,1 µm. Cydonia oblonga Mill. 28/K = 26,1 µm; 11/K = 25,6 µm; 24/K = 23,3 µm; 17/K = 23,1 µm.

VÝSLEDKY – kandidátní rostliny Graf 12: Velikost průduchů u kandidátních rostlin v porovnání s průměrnou hodnotou kontrolních rostlin a rozdíl znázorňující zvětšení průduchů.

VÝSLEDKY PRÁCE Statistickou analýzou byly potvrzeny vysoce průkazné rozdíly ve velikosti průduchů u všech zkoumaných druhů. Tab. Průměrná délka průduchů a rozdíly v µm, 2 měření Ovocný druh ošetřená varianta kontrola rozdíl Pyrus betulaefolia 34,89 32,49 2,4 Pyrus communis 35,84 30,89 4,95 Malus domestica 29,44 27,47 1,97 Cydonia oblonga 22,48 21,72 0,76

VÝSLEDKY PRÁCE Porovnání průměrné délky průduchů všech hodnocených druhů, ošetřených kolchicinem, neošetřených kontrolních rostlin a triploidů

VÝSLEDKY PRÁCE

VÝSLEDKY Pyrus communis L. kolchicin U rodů Malus a Cydonia velikost průduchů výrazně kolísala, což může poukazovat i na vysoké procento chimérních , mixoploidních jedinců, kteří mají jak pletiva diploidní, tak i polyploidní. Průduchy, zv. 800x

Morfologické projevy ošetřených rostlin v roce 2012 Rostliny jsou velice nevyrovnané v růstu Odlišnosti v délce a šířce listové čepele Výrazně zvětšené palisty Barva výhonu a plstnanost Barva listů, řapíků a plstnatost Pilovitost okrajů listů Pomalý růst

Pyrus betulaefolia Bunge. Kontrola

Pyrus betulaefolia Bunge.

Pyrus betulaefolia Bunge.

Pyrus communis L. 3/H Kontrola

Pyrus communis L. 12/H 2/H

Malus domestica Borkh. 6/J Kontrola

Malus domestica Borkh. 24/J 12/J

Cydonia oblonga Mill. 14/K Kontrola

ZÁVĚR V tomto experimentu byla s určitou pravděpodobností úspěšně indukována mitotická polyploidie. Pomocí alkaloidu kolchicinu byly zasaženy meristematické buňky během buněčného dělení. Tento zásah tak ovlivnil vývoj rostlin již od raných fází, kdy už docházelo k určitým změnám v jejich morfologii a fyziologii.

ZÁVĚR U všech zhodnocených druhů byly zjištěny statisticky průkazné rozdíly ve velikostech průduchů. Ovšem tyto výsledky by se měly ověřit ještě pomocí jiných metod např.: Počítáním chloroplastů ve svěracích buňkách Hodnocením velikosti a tvaru pylových zrn a fertility pylu Méně spolehlivé metody→ neodlišení mixoploidů Nejlépe pomocí průtokové cytometrie.

ZÁVĚR Vybrané kandidátní rostliny se budou nadále pozorovat a hodnotit i v dalších letech. Do budoucna je možné jejich další využití ve šlechtění. Pokud se prokáže stabilita a nevratnost indukovaných změn. Mohou přispět k rozšíření sortimentu a tvorbě odolnějších a výkonnějších odrůd pomocí křížení. Krátce výstižně vyjádřit co jsem vlastně vyzkoumal a k jakých výsledkům jsem dospěl!!! 􀂾 V kterém z bodů byla moje práce přínosná…stručně členěný v bodech

Děkuji za pozornost

OTÁZKY OPONENTA ……………………. …….

PŘEVZATÉ OBRÁZKY Jablko a hruška http://www.wallpaper.cz/priroda/flora/jablko_a_hruska Kolchicin http://www.mpo.cz/cz/prumysl-a-stavebnictvi/dance2009/vypis964.html Ocún http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Nsr-slika-144.png Jablko http://mishaa.blog.cz/0805/jablka tetraploidních pícnin a trav, které jsou významné vyšší produkcí zelené hmoty, a byly vyšlechtěny na šs Hladké životice.