4. CENTRIFUGACE Podmínka dělení: l ≥ 1 suspenze  emulze  koloidní roztoky (NK, bílkoviny)

Rychlost sedimentující částice v Frikční koeficient Stokesův zákon Relativní odstředivé zrychlení R – násobek g N = r.p.m. sedimentační koef. S[sec] x sedimentační konst. →Extrapolace na C0 →20o C →H2O

Svedbergova jednotka 1S=1x10-13 sec

4.1. METODY 4.1.1. DIFERENCIÁLNÍ CENTRIFUGACE metoda pohyblivého rozhraní Dělení podle S Podmínka : ΔS max.; Smax na dno (≈ t, N) Výhody: Jednoduché Nevýhody: Pouze 1 složka STĚNOVÝ EFEKT – nedokonalé dělení

4.1.2. CENTRIFUGACE V KONCENTRAČNÍM GRADIENTU ZONÁLNÍ Kontinuální Diskontinuální Sacharosa Dextran FICOL ρ ≥ 1,3 g/cm3

4. 1. 2. ZONÁLNÍ CENTRIFUGACE a. RYCHLOSTNÍ b. IZOPYKNICKÁ c 4.1.2. ZONÁLNÍ CENTRIFUGACE a. RYCHLOSTNÍ b. IZOPYKNICKÁ c. IZOPYKNICKÁ ROVNOVÁŽNÁ- automatické vytváření gradientu ( CsCl ρ≤1,9; F3AcOCs ρ≤2,6 g/cm3 ) a. RYCHLOSTNÍ b. IZOPYKNICKÁ Výhody Dokonalejší dělení Nevýhody Malé množství Separace zón obtížná (propíchnutí) Stěnový efekt ρ < ρč S ≈ r2 ρ > ρč ρ

Centrifugační zkumavky Skleněné Z umělé hmoty: Ependorfky Zkumavky s víčkem QUICK – SEAL polyallomer tubes

4.2. TYPY ODSTŘEDIVEK

4.2.1. DISKONTINUÁLNÍ ODSTŘEDIVKY s výměnným rotorem a. Se závěsnými kyvetami α = 90o V = 30 ml – 3 l, N = 3 – 10 000 S úhlovým rotorem b. α = 14 -40o c. α = 0o N =33 000 Výhody: Nevýhody: Krátká dráha Zvíření Úzká zóna

Výměnné rotory Beckman

d. se zonálním rotorem Postup Jádro rotoru s přívody Jádro s rameny Stěna rotoru Vrotoru = 0,6 – 1,6 l Vvzorku = 20 – 200 ml 4. Gradient hustoty 5.Podložní roztok – cushion 6.Překrývající roztok – overlay Postup Plnění N = 103 ot/min Dělení centrifugací N = 104 ot/min 3. Vytlačování N = 103 ot/min

Čištění transformační DNA z b.subtilis centrifugací v zonálním rotoru 27 mg surové DNA/15 ml Gradient sacharosy 5-30% Citrátový pufr pH 7,0 Cushion – 50 ml 42% sach. Overlay – 100 ml pufru Plnění - 2 000 ot/min Dělení – 40 000 ot/min 7 hod Jímané frakce 10 ml Bílkoviny + RNA DNA agregáty DNA 2,5 S 26 -35 S

4.2.2. KONTINUÁLNÍ ODSTŘEDIVKY Typ SHARPLES N = 40 000 ot./min Výhoda: Velká kapacita 20 – 50 l/hod. Suspenze i emulze Průmyslové kaly

4.3. POUŽITÍ CENTRIFUGACE Separace (čištění) průmyslové kaly, emulze, Centrifugace – nejčastější metoda, nejdůležitější Separace (čištění) průmyslové kaly, emulze,  bílkoviny, NK, organely, buňky, viry, Diferenciální – počátek separace, zpracování homogenátů tkání, náhrada FILTRACE Zonální – dokonalejší, frakcionace Analýza - M

)

4.4. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE 20.léta Svedberg a j.: důkaz – makromolekuly ne agregáty, ale spojeny kovalentními vazbami  rozvoj chemie makromolekul 1958 Mathew MESSELSON + Franklin STAHL: důkaz semikonzervativní replikace DNA  rozvoj molekulární biologie Expanze a útlum AU Vzkříšení v 90. letech: kombinace moderních přístrojů a počítačového softwaru pro zpracování dat AU SV – sedimentační rychlost: S a hydrodynamické vlastnosti SE – sedimentační rovnováha: M, Kasociace

Důkaz semikonzervativní replikace DNA 1958 Mathew MESSELSON + Franklin STAHL

4.4.2. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGA

Analytická centrifuga BECKMAN –COULTER XL-I 100 000 rpm T = 4 - 40ºC Detekce→ UV, VL absorpce, interference index lomu  Detekce neabsorbujících biomakromolekul (sacharidy) Detekce změn konformace nebo asociace bílkovin vlivem ligandů nebo léčiv Vhodnější pro SV celých buněk – rychlejší akumulace dat

4.4.3. ANALYTICKÁ CENTRIFUGA - DETEKCE Šlíry (index lomu) Interference Fotografická absorbance (Schachman 1959) Fotoelektrická absorbance- současný optický systém

Kyveta pro AU Dráha – 1,5 cm Obsah 20-200 μl c - 0,1mg/ml

Metoda pohyblivého rozhraní - SV

4.4.4. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE -VYUŽITÍ Stanovení M Bez kalibrace (x GPC a ElFo) Široký rozsah: 102 (sacharosa, AA) – 106 (viry, organely) !!! Malé množství (20 – 120 μl) i c (0, 01 – 1 g/l), i vysoká c Stanovení homogenity rychlé, kvantitativní určení distribuce částic, stupeň agregace volně v roztoku, nativní, bez případné interakce s matricí Analýza asociujících systémů – široký rozsah: interakcí jak existují v roztoku (makromolekuly s ionty a malými, solvatace, agregace) M c K (10 – 100 M-1 ) 4. Určení pravděpodobného tvaru (koule x cylinder). Detekce konformačních změn ?

4.4.5. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE - ZÁVĚR AU je všestranná, přesná metoda pro studium biomakromolekul v roztoku při vybrané T M a S Kasociace Solvatace, agregace Heterogenita roztoku Tvar, změny konformace