5. ročník Klinická genetika Cytogenetická a molekulárně cytogenetická vyšetření v klinické genetice 5. ročník Klinická genetika

Eduard Kočárek eduard.kocarek@lfmotol.cuni.cz Eduard.Kocarek@seznam.cz Tel. 224435980 (pracovna) Tel. 257296151 (TPÚ Plzeňská) sekretariát ÚBLG tel. 224 433 500 – 502

Doporučená literatura ke studiu Kočárek E., Pánek M., Novotná D.: Klinická cytogenetika I. skriptum UK 2.LF, Karolinum, Praha, 2006 Michalová K.: Úvod do lidské cytogenetiky. IDVPZ (NCO NZO), Brno, 1999 Nussbaum R. L., McInnes R. R., Willard H. F.: Thompson & Thompson – Klinická genetika. Triton, Praha, 2004

Základem cytogenetického vyšetření je analýza chromozomů.

Základní cytogenetické vyšetření Buňky v metafázi – možnost vizualizace jednotlivých chromozomů Klasické barvení G-pruhování R-pruhování C-pruhování Q-pruhování Ag-NOR

Molekulárně cytogenetická vyšetření Identifikují změny chromozomů molekulárně biologickými metodami K vyšetření většinou postačí jádra interfázních buněk (s výjimkou malovacích sond u FISH) Příklady metod hybridizace in situ a její modifikace (CGH, M-FISH, fiber FISH atd.) Genové čipy, resp. array CGH, DNA microarray atd. PRINS, PCR in situ fluorescenční kvantitativní PCR, real time PCR metody založené na dodatečné amplifikaci navázané sondy (MLPA, MAPH) hybridizace PCR

FISH (fluorescenční in situ hybridizace) centromerická lokus specifická cílová DNA denaturace hybridizace sonda malovací sonda

Algoritmus cytogenetických a molekulárně cytogenetických vyšetření

Cytogenetické vyšetření chromozomů Pacient Cytogenetické vyšetření chromozomů Příbuzní pacienta Molekulárně cytogenetické vyšetření (FISH, eventuálně PRINS) Molekulárněbiologické vyšetření

Před indikací cytogenetického vyšetření Vyloučit možnost mimogenetického postižení Vliv teratogenů, resp. prenatálních infekcí Komplikace při porodu Postnatální negenetická afekce (traumata, infekce) Uvážit, zda nejde o monogenní či multifaktoriální chorobu (které nemají vliv na karyotyp)

Indikace pro postnatální chromozomová vyšetření

Fenotyp je typický pro konkrétní syndrom, resp. chromozomovou aberaci Vyšetřujeme příslušnou chromozomovou abnormalitu Mnohočetné vrozené anomálie Aneuploidie autozomů, mikrodelece chromozomu 22q11.2, nebalancované chromozomové přestavby Růstová retardace Turnerův syndrom, subtelomerické aberace chromozomů Mentální retardace (včetně idiopatické MR) Subtelomerické aberace chromozomů, Prader-Willi syndrom, Angelmanův syndrom, Williams-Beuren syndrom, Smith-Magenis syndrom, Miller-Dieker syndrom, popř. jiné strukturní chromozomové aberace, trizomie 8 v mozaice Neurologické symptomy (křeče, ataxie atd.) Angelmanův syndrom, invertovaná duplikace chromozomu 15, subtelomerické delece Vrozené srdeční vady Mikrodelece 22q11.2, Williams-Beuren syndrom, Turnerův syndrom Poruchy funkce gonád, dysgeneze gonád či genitálu Numerické či strukturní aberace gonozomů, mozaiky XX/XY, popř. X0/XY, X0/Xder(Y) Infertilita, resp. opakované spontánní potraty, úmrtí novorozence Turnerův syndrom, Klinefelterův syndrom a jiné aneuploidie chromozomu X, balancované chromozomové přestavby (přenašeči) Výskyt malignit Syndromy chromozomové instability, vrozené či získané chromozomové aberace (amplifikace onkogenů, delece tumor supresorových genů, fúzní geny, chromozomové přestavby)

Co uvést v indikaci? Jméno, rodné číslo, zdravotní pojišťovnu pacienta (event. též adresu, číslo chorobopisu) Materiál, který k vyšetření posíláme Datum odběru Pracovní diagnózu číslem dle MKN Pracovní diagnózu slovy (uvést podezření na konkrétní syndrom, resp. chromozomovou poruchu) Které vyšetření má být provedeno U cílených molekulárně cytogenetických vyšetření – které konkrétní aberace, resp. chromozomové lokusy mají být vyšetřeny Dobu uložení vzorku Naléhavost (STATIM?) Čitelný podpis lékaře (+ odbornost, IČP), popř. kým byl pacient k indikujícímu lékaři zaslán. Datum indikace

Vzorky tkání pro postnatální vyšetření Periferní krev Fibroblasty z kožní biopsie Epiteliální buňky z bukálního stěru (jen výjimečně pro stanovení sex-chromatinu nebo FISH) Kostní dřeň (hemoblastózy) Nádor Sekční materiál (v případě úmrtí pacienta) → Desinfikovat místo vpichu alkoholem → Krev do zkumavky s heparinem → Používáme Li-heparin, popř. Na-heparin

Kdy je třeba indikovat FISH? V materiálu nejsou přítomny mitózy Neúspěšná kultivace Odebranou tkáň nelze kultivovat (preimplantační vyšetření, rychlá prenatální vyšetření, vyšetření solidních tumorů, popř. sekčního materiálu z jiných tkání) Verifikace složitějších chromozomových přestaveb, identifikace marker chromozomů Verifikace mozaiky (zejména nízkofrekvenční) Diagnostika submikroskopických (kryptických) chromozomových přestaveb Mikrodeleční syndromy Amplifikace onkogenů a mikrodelece tumor-supresorových genů u malignit

Kdy je třeba (v návaznosti na cytogenetickou analýzu, resp Kdy je třeba (v návaznosti na cytogenetickou analýzu, resp. FISH) indikovat molekulárněbiologické vyšetření? Podezření na některou z monogenních chorob (např. syndrom fragilního X) Neúspěšné vyšetření metodou FISH, tj. vyloučení delecí a jiných mutací na úrovni DNA, které nejsou molekulárně cytogeneticky detekovatelné. Vyloučení uniparentální izodizomie, popř. jiných odchylek na bázi imprintingu a abnormální methylace genů

Indikace Výsledek INDIKACE materiál podle potřeby Tkáň lze kultivovat in vitro Tkáň nelze kultivovat in vitro, popř. hrozí nebezpečí z prodlení (u prenatálních vyšetření) Vyšetření aberace, která byla molekulárně cytogeneticky zjištěna již u ostatních členů rodiny buňky v metafázi (kultivované lymfocyty, amniocyty, buňky kostní dřeně atd.) interfázní buňky (nádorové buňky, nekultivované amniocyty atd.) materiál podle potřeby Cytogenetické vyšetření Negativní nález, nutnost podrobnějšího vyšetření např. mikrodeleční syndromy Nález chromozomální aberace, nutnost verifikace a upřesnění nálezu např. marker chromozomy, složité chromozomální přestavby, mozaiky Nález a popis chromozomální aberace např. aneuploidie, jednodušší chromozomální přestavby Molekulárně cytogenetické vyšetření VÝSLEDEK VYŠETŘENÍ Výsledek

Kdy indikovat a kdy neindikovat? Případy s typickým fenotypem Procento pozitivních nálezů CHA Neobvyklé případy umožňující lepší poznání syndromu a variability jeho fenotypových projevů Rozsah postižení, popř. počet typických znaků

Ukázka postupu cytogenetického a molekulárně cytogenetického vyšetření

Pacient 1 Pacient 1 je 2letý mentálně retardovaný chlapec. Interní vyšetření prokázalo vrozenou srdeční vadu (supravalvulární aortální stenózu). Prohlédněte si fotografii pacienta 1 a povšimněte si abnormálních fenotypových znaků.

Pacient 1 (chlapec, 2 roky) irides stellatae hypertelorismus otevřená ústa, silné rty „elfin face“

Pacient 1 Kombinace fenotypových projevů a vrozených vad by mohla svědčit pro Williamsův-Beurenův syndrom, který je u 95% pacientů způsoben mikrodelecí dlouhých ramének chromozomu 7 (přesněji 7q11.23). Mikrodeleci lze vyšetřit metodou FISH. Před molekulárně cytogenetickou analýzou je však vhodné provést běžné cytogenetické vyšetření.

Mikrodeleci je třeba vyšetřit metodou FISH Karyotyp pacienta 1 46,XY Mikrodeleci je třeba vyšetřit metodou FISH Který typ sondy byste k vyšetření mikrodelece chromozomu 7 metodou FISH použili?

MOLEKULÁRNĚ CYTOGENETICKÁ ANALÝZA MIKRODELECE 7q11.23 ELN LIMK1 D7S613 CENTROMERA TELOMERA 180 kb LOKUS SPECIFICKÁ SONDA PRO KRITICKOU OBLAST ELN/LIMK/D7S613 (značena Spectrum Orange, červený signál) KONTROLNÍ SONDA D7S522 (značena Spectrum Green, zelený signál)

Pacient 1 – závěr vyšetření Mikrodelece chromozomu 7q11.23 prokázána. Diagnózu Williamsův-Beurenův syndrom lze potvrdit. Jak byste postupovali v případě, kdyby se mikrodeleci chromozomu 7 nepodařilo metodou FISH prokázat?

Při negativním nálezu mikrodelece uvážíme: Deleci nebo jinou mutaci malého rozsahu v kritickém regionu. Postižení v jiném lokusu Afekci na negenetické bázi (zejména vliv teratogenních faktorů během těhotenství)

Díky za pozornost!