Monomerní G-proteiny mirka.rovenska@lfmotol.cuni.cz

G-proteiny = guanine nucleotide-binding proteins v aktivním stavu vážou GTP, v neaktivním GDP katalyzují hydrolýzu GTP → GDP + P Heterotrimerní G-proteiny 3 podjednotky (α,,γ) spřaženy s „G protein-coupled receptors“ výměna GDP v α-podjednotce za GTP → disociace α od γ → interakce α s efektorem, hydrolýza GTP → deaktivace Monomerní G-proteiny = malé GTPasy: Mr = 20-25 kDa nejsou přímo spřaženy s GPCRs podobně: výměna GDP za GTP → interakce s efektorem, hydrolýza GTP → deaktivace

Malé GTPasy GDP/GTP-regulované molekulární „přepínače“ signálních drah Dva konformační stavy lišící se aktivitou: Efektory: proteinkinasy fosfatidylinositol-3-kinasa: přeměňuje PIP2 na PIP3, který reguluje aktivitu dalších cílových molekul fosfolipasy… hydrolýza GTP GTP-protein aktivní konformace vyšší afinita pro efektor GDP-protein inaktivní konformace nízká afinita pro efektor výměna GDP za GTP

Regulační proteiny Výměna GDP za GTP i hydrolýza GTP probíhají i bez účasti jiných proteinů (vlastní aktivitou malé GTPasy), avšak pomalu Regulační proteiny mění rychlost těchto procesů: GEFs (guanine nucleotide exchange factors) urychlují výměnu nukleotidů GAPs (GTPase-activating proteins) urychlují hydrolýzu GTP GDIs (guanine nucleotide dissociation inhibitors) blokují aktivaci Aktivace: signál vedoucí k aktivaci GEF → výměna GDP v G-proteinu za GTP → interakce s efektorem

Klasifikace malých GTPas Bylo identifikováno přes 150 lidských monomerních G-proteinů, které tvoří tzv. nadrodinu Ras Nadrodina Ras se na základě sekvenční a funkční podobnosti dělí do rodin a ty dále do podrodin; hlavní rodiny: Ras, Rab, Rho, Arf, Ran Nadrodina Ras rodiny podrodiny

Posttranslační modifikace malých GTPas – prenylace Význam prenylace: pravděpodobně usnadňuje interakci se specifickými oblastmi membrány Ras: farnesyltransferasa – kovalentní navázání farnesylu (C15) na Cys v C-terminálním motivu CAAX (X = S, M) Rho, Ras: geranylgeranyltransferasa I – kovalentní navázání geranylgeranylu (C20) na Cys v C-terminálním motivu CAAX (X = L, F) Rab: geranylgeranyltransferasa II – kovalentní navázání geranylgeranylu na Cys C-koncových motivů CC, CXC, CCX, CCXXX

Guanine Nucleotide Exchange Factors (GEFs) Usnadňují výměnu volného GTP (z cytosolu) za vázaný GDP, a tak regulují aktivaci malých GTPas Různé rodiny GEFs rozeznávají různé rodiny malých GTPas

GEFs jsou aktivovány různými signály GEFs mají obvykle různé signální domény, které odpovídají na různé signály: Ca2+ signály působící přes tyrosinkinasy DAG… Všechny tyto signální dráhy zprostředkovávají spojení s GEFs s membránou tyrosinkinasový receptor (po dimerizaci) signální molekula aktivace Sos = GEF pro Ras adaptorový protein http://uk.images.search.yahoo.com/search/images;_ylt=A0WTf2xcsHpLlWsAjaJNBQx.?p=sos+ras+sh2&fr=yfp-t-702&ei=utf-8&x=wrt&y=Search

GTPase Activating Proteins (GAPs) Urychlují hydrolýzu GTP, čímž zabraňují tomu, aby aktivace trvala příliš dlouho Opět existují strukturně odlišné GAPs pro různé rodiny malých GTPas Mutované proteiny Ras lidských karcinomů (substituce 1 AA) nereagují na GAP  přetrvává (aktivní) konformace s navázaným GTP  dysregulace efektorů

Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitors (GDIs) Inhibují aktivaci dvěma způsoby: 1. váží se na isoprenoidový řetězec, a tak zabraňují asociaci malé GTPasy s membránou 2. jejich navázání ruší regulaci prostřednictvím GEF, a tím zabraňuje aktivaci malé GTPasy Jsou méně specifické než GEFs a GAPs Zatím identifikovány u Rho a Rab

Struktura malých GTPas Všechny malé GTPasy mají tzv. G-doménu, která obsahuje: sekvence vázající a hydrolyzující GTP, sekvence zodpovědné za interakci s efektorem (a také s GEFs a GAPs) a změnu konformace mezi stavy s GTP/GDP (switch I, II) G-doména je podobná u všech malých GTPas (až na malé odlišnosti): Různá sekvence switch I a II u jednotlivých malých GTPas podmiňuje jejich různou specifitu vůči vazebným partnerům

Různé funkce malých GTPas Široké spektrum buněčných funkcí malých GTPas je umožněno tím, že: různé signály regulují různé GAPs a GEFs různé malé GTPasy interagují s různými efektory Přehled hlavních funkcí malých GTPas: Ras: regulace proliferace a diferenciace buněk Rab, Arf: membránový transport (sekrece, endocytosa) Ran: regulace nukleocytoplasmatického transportu Rho: organizace cytoskeletu (regulace metabolismu aktinu)

Rodina Ras Funkce: proliferace a diferenciace buněk Mutace Ras proteinů u lidských nádorů blokují hydrolýzu GTP – bazální i stimulovanou GAPs – a tak udržují proteiny Ras v aktivní GTP-konformaci Signální dráha kontroly proliferace: Grb2,SHC – adaptorové proteiny (vazba Sos) Sos = GEF pro Ras Raf, MEK, MAP – Ser/Thr proteinkinasy TF = transkripční faktor; po fosforylaci aktivuje genovou expresi

Ras jako uzel signálních drah 1. Konvergují v něm nejrůznější signály: růstové faktory (epidermální růstový faktor) hormony (insulin) cytokiny proteiny extracelulární matrix (přes integriny) 2. Aktivuje mnoho různých efektorů, a tím reguluje mnoho různých dějů: Raf (Ser/Thr kinasa) fosfatidylinositol-3-kinasa GEFs jiných malých GTPas PLCε – štěpí PIP2 na IP3 a DAG (druzí poslové)

Rodina Rab Funkce: membránový transport: regulují tvorbu váčků z výchozích membrán, jejich transport v buňce i fúzi s cílovou membránou Největší rodina malých GTPas (u člověka minimálně 60 proteinů) Lokalizace: v organelách sekrečních a endocytických drah: Golgi endosomy melanosomy sekreční granula mastocytů…

Buněčná lokalizace GTPas rodiny Rab 1. Endocytóza: internalizace do clathrinových váčků (CCV) → transport do „early/sorting endosomes“ (SE) a třídění: následuje buď degradační dráha – přes „late endosomes“ (LE) a lysosomy (Lys) – nebo transport k plasmatické membráně (přímo ve formě SE nebo přes ERC). 2. Biosyntéza: proteiny transportovány z ER do Golgiho komplexu, odkud putují v sekrečních váčcích (SV) k povrchu buňky.

Rodina Ran Nacházejí se ve všech jaderných buňkách všech eukaryot – funkce: regulace aktivního transportu mezi jádrem a cytoplasmou v interfázi (transkripční faktory a histony z cytoplasmy do jádra, tRNA a mRNA naopak) v cytoplasmě je RanGAP  RanGTP přechází na RanGDP v jádře je RanGEF  výměna GDP za GTP a aktivace Rab transport z cytoplasmy do jádra: RanGTP v jádře se váže na importní komplexy a uvolňuje z nich náklad transport z jádra do cytoplasmy: RanGTP v jádře napomáhá tvorbě exportního komplexu → hydrolýza GTP v cytoplasmě vlivem RanGAP → uvolnění „nákladu“ v cytoplasmě tvorba a lokalizace mitotického vřeténka a opětné zformování jaderného obalu při mitóze (RanGTP uvolňuje proteiny potřebné pro tvorbu vřeténka)

Rodina Rho Tyto proteiny regulují metabolismus aktinu  funkce: regulace cytoskeletu. Díky tomu modulují nejrůznější buněčné děje: 1. migrace buněk 2. tvar buněk 3. sekrece a endocytosa 4. proliferace a transformace (role Rho ale ještě není přesně známa) 5. interakce buněk

Efektory rodiny Rho GTPasa Rho Efektory Funkce RhoA, B, C ROCK I, II (kinasa) aktomyosinová kontraktilita adheze buněk Cdc42 WASP polymerizace aktinu a tvorba filopodií…směrování migrace Rac1, 2, 3 IRSp53 polymerizace aktinu a tvorba lamelipodií…hybná síla migrace

Model aktivace efektoru působením GTPas rodiny Rho Aktivace WASP činností Cdc42 V nepřítomnosti Cdc42-GTP je WASP v inaktivní konformaci Aktivace Cdc42-GDP vazbou GTP  Cdc42-GTP váže WASP  změna konformace WASP: odkryje se doména VCA, která nyní může aktivovat komplex Arp2/3, nezbytný pro polymerizaci aktinu