C7900 Lehká biotechnologie 15 – Organické kyseliny Petr Zbořil

Osnova prezentace Kyselina octová Kyselina citronová

Kyselina octová Tvorba Oxidací etanolu – 2 enzymy (forma celých buněk – ostatní metabolismus, ale hlavní cesta produkce energie) Oxidace etanolu u A. aceti. Matsushita K. a kol.: J. Bacteriol. 187, 4346-4352 (2005)

Kyselina octová Jiné cesty – i anaerobní Častý vedlejší produkt produkt Heterofermentativní procesy Z glukosy aj., méně efektivní

Suroviny Etanol čistý, upravený, doplněný dalšími živinami Etanol ve formě fermentačního media – kvasu (víno, pivo), vyčeřené upravené Glukosa aj. sacharidy, málo užívané způsoby

Mikroorganizmy Nejspecifičtější rod Acetobacter, tvoří téměř výlučně kyselinu octovou A. aceti, , xylinum, oxydans, aj. Některé oxidují etanol na další (nežádoucí) produkty H2O a CO2 – přeoxidace, zvl. při vyčerpání etanolu, aj. Další kyseliny – propionová, mléčná, galakturonová, různé příchutě octa Výběr se řídí živným mediem Liší se schopností metabolizovat pivo (vadí chmelové látky), víno, mladinu atd.

Způsoby procesu Zakotvený systém, náplňový fermentor – ocetnice Klasický způsob Submerzní systém, suspenze bakterií v mediu Míchaný fermentor Flotační fermentor – „airlift“

Kyselina octová Povrchový způsob, zakotvené bakterie Fermentor (obvykle dřevěný) o 3 oddílech, střední s náplní (bukové hobliny, lze i jiné – škvára, koks, dřevěné uhlí …) porostlou vrstvičkou bakterií v matrix Skrápí se „ředinou“ – zpočátku ca 10,8% etanol a 1,2% kys. octová, doplněna dalšími živinami – dle typu suroviny (čistý etanol x kvasy) Protiproudem je vháněn vzduch, oxidací etanolu vzniká kys. octová, produkuje se teplo – chlazení! Recirkulace po ca 7-8 dní, pokles etanolu na ca 0,3%, kontrolovat, nebezpečí přeoxidace!

Ocetnice Náplň (hobliny) Zásobník řediny, Úprava, T = obtok Výdech Chladič Teploměry Vzduch průtokoměr Recyklace media

Demontáž ocetnice

Dubové hobliny

Tady stávaly ocetnice

Končíme

Ocet – povrchový způsob Zavedení provozu Zaočkováním sterilních (propařených a 8% kys. octovou nasycených hoblin), nárůst vrstvy řádově týdny Nejlépe starým octem – prokvašeným mediem Dosáhne se 14 – 15 % produkt Méně čistou kulturou Produkt 11 – 12 % Periodický provoz – cyklické střídání Odčerpání produktu Aplikace čerstvé řediny – přípravná místnost Regenerace náplně – po 8 – 10 letech (i 20 – 30) Odstranění hlenů propláchnutím vodou

Ocet – důležité podmínky Teplota – 29 – 34 oC (podle polohy) Exotermní pochod, nutnost chlazení Čidla, vnější chladič, rychlost cirkulace – přepad, obtok (mění se i rychlost oxidace etanolu) Snížená aktivita bakterií při vyšší teplotě (i nižší) Vzduchování intenzivní, využije se 50% dodávaného kyslíku 4144 L / 1 L etanolu Koncentrace a čistota etanolu Optimálně 6 – 7 % nad 14 % zastaví proces, pod 1% hrozí přeoxidace Příměsi dodávají příchutě (estery) nebo pachutě Mohou též inhibovat proces

Ocet – důležité podmínky Živiny Sacharidy (glukosa, sacharosa) Minerální komponenty – fosfát, K, Na, NH4+, Mg Voda – obsažena v produktu, příměsi se neředí Nevhodné komponenty ovlivňují chuť, vůni, barvu Vadí Fe, N-látky, tvrdost, mikrobiální kontaminace Úprava podle potřeby – měkčením, sterilizací Kovy Inhibice: Pb  Cu  Fe  Zn  Sn Stimulace uranylacetátem – přidává se (?)

Ocet Finální úprava Filtrace Ředění Barvení, aromatizace Pasterizace Průmyslové využití – 12 – 14 % Potravinářský ocet 8 – 10 % Barvení, aromatizace Vlastní aroma – dle suroviny Bylinné extrakty apod. (estragon) Pasterizace

Ocet – submerzní způsob

Ocet – submerzní způsob Kyselinovzdorné ocelové acetátory Sterilní medium se standartně zaočkuje kulturou Bakterie během cyklu rostou Na 1 L octa přiroste 300 g (?) biomasy bakterií Významná intenzivní aerace Min. 4 % O2 ve vycházejícím vzduchu Pod tuto hodnotu klesá výkon proti růstu Přerušení aerace na 60 s nevratně zastaví proces

Ocet – submerzní způsob Provozní fermentor s průtokoměrem vzduchu (acetátor) Rozměry – viz žebřík

Kyselina citronová Metabolický základ produkce Citrátový cyklus Jiné cesty sporadické, dle mikroorganizmu např. kondenzace malátu a glykolátu

Kyselina citronová Hromadění Doplňování metabolitů TCA Export Inhibice dalšího metabolizmu Snížení obsahu Fe v mediu – malá aktivita ICDH Mutanti se sníženou produkcí akonitasy Doplňování metabolitů TCA Anaplerotické dráhy Pyruvát – oxalacetát (karboxylace) – inkorporace CO2 Glyoxylátová zkratka Výtěžky nad 100% pro stechiometrii glyoxylátové cesty, význam karboxylace – experimentálně potvrzeno pomocí 14C Export

Kyselina citronová – export Navržené schema exportu citrátu u A. niger CTP – citrát transportující protein CP – citrát permeasa (? – neidentifikovaný protiion)

Kyselina citronová Produkční mikroorganizmy Aspergillus niger Mutanty se sníženou aktivitou akonitasy a ICDH Zvýšená aktivita enzymů na syntetické cestě Pasážování za vhodných podmínek Udržování vlastností Výběr dle požadovaných vlastností Nejlepší hromadí až 10 % kys. citronovou Některé hromadí i jiné kyseliny Glukonová, oxalová Další uvažovaní producenti

Kyselina citronová Produkční způsoby Povrchový – emerzní Hloubkový, submerzní Míchaný nebo flotační fermentor („airlift“) Fermentace pevné fáze – jednoduchá

Kyselina citronová – povrchový proces Suroviny – sacharidy Melasa Variabilní složení (oblast, typ, ročník, technologie apod.) Stimulující komponenty Koloidní nebo vázaný na koloid Nespotřebovává se, je obsažen i v odpadních louzích Zvyšuje výtěžnost z 25 – 30 % na 55 – 60 % Inhibiční komponenty Kovy (Fe aj.), lépe roste mycelium, horší produkce Úprava dle analýz a testovacích fermentací Řědění na požadovanou konc. sacharosy Odstranění kovů – srážení, katexy Úprava pH (dle typu media), doplnění fosfátu apod.

Kyselina citronová – povrchový proces Media Sporulační – laboratorní fáze Účelem je naprodukovat maximální množství spor k výsevu Není nutno vyloučit produkci vedlejších produktů Ukazatelem je růst a sporulace Produkční Nemají se tvořit konidiospory Mycelium má ukončit vývoj dřív než kvašení (limitace biogenním prvkem, obvykle N) Ukazatelem je produkce citrátu Nemají se tvořit jiné produkty (kyseliny)

Kyselina citronová – povrchový proces Zařízení Kvasné mísy pro povrchovou kultivaci Korozivzdorný materiál Fe s inertním povlakem (smalt), Al Rozměry se řídí podmínkami fermentace a manipulačními možnostmi Výška media 8 – 9 cm Malé jsou neúsporné, velké se mohou deformovat – dle materiálu Kvasné komory pro naskládání mis Regály Rozvod temperovaného (30 oC) sterilního vzduchu

Kyselina citronová – povrchový proces Zařízení

Kyselina citronová – povrchový proces Zařízení

Kyselina citronová – povrchový proces Postup Laboratorní příprava Produkce spor, testování melasy apod. Plnění kvasných mis upravenou sterilní melasou Zaočkování media sporami Směs spor s karborafinem ve asepticky vpraví do proudu vzduchu rozváděného v komorách nad jednotlivé mísy Růst mycelia a fermentace Po ca 36 hod. souvislý povlak Růst extracelulární invertasy, max. ca 4. den Všechna sacharosa hydrolyzována, max. rychlost produkce citrátu Sleduje se titrační kyselost a gravimetricky stanovuje citrát Ca Pokles produkce, odtažení media (hadičky) k izolaci

Kyselina citronová – izolace Stažení kvasu do usazovacích kádí Mycelium lze ev. znovu použít – zůstane v mísách Mycelium lze sebrat, rozdrtit, extrahovat vodou (60 oC) Filtrace usazeniny a ev. extraktu Srážení Ca-citrátu Čirý roztok z usazováku a filtrát, přídavek Ca(OH)2 při 40 – 50 oC Reakcí se směs zahřeje na 70 – 80, parou pak na 95 oC, míchání 15 min. Odfiltrování Ca-citrátu (vakuová nuč, bubnový filtr)

Kyselina citronová – izolace Uvolnění kys. citronové Sraženina se rozloží kys. sírovou při ca 70 oC Oddělení CaSO4 filtrací Filtrát se nechá ochladit a usadit (CaSO4), další filtrace Krystalizace Zahuštění filtrátu na vakuové odparce Krystalizace (I. Zrno) Opakování (II. A III. Zrno) Další čištění, rafinace (II. a III. zrno) Podle účelu, dalšího užití Karborafin, ionexy

Kyselina citronová – izolace

Kyselina citronová Využití Potravinářství – ca 65% Farmacie – ca 20% Nápoje, kompoty, zmrzlina apod. Chuťové, konzervační a antioxidační vlastnosti Farmacie – ca 20% Antikoagulační činidlo Ostatní – ca 15% bělění, leptání mycí a čistící prostředky – náhrada fosfátů

Kyselina citronová – submerzní fermentace Moderní způsob, většinou nahradil ostatní Mycelium tvoří granule, pelety Od 2. pol. r. 1986 zavedeno u nás, dnes výroba zanikla Substrát se připravuje a steriluje v tanku Produkční medium se připraví a sterilizuje ve fermentoru Současně se připraví zaočkuje růstové medium sporami na nosiči (obilná zrna) Po 24 h se vytvoří ze shlukujících se hyf pelety Peletami se zaočkuje produkční fermentor Fáze růstu je po ca 42 - 52 hod. vystřídána fází produkční, hromadí se kys. citronová

Kyselina citronová – submerzní fermentace Výhody Úspora prostoru Vyšší kapacita Jednodušší operace Mechanizace a automatizace Menší nebezpečí kontaminace Nevýhody Nižší výtěžky Vzniká více kyseliny glukonové a šťavelové

Kyselina citronová - Kaznějov http://zskaznejov.webnode.cz/products/historie-chemicke-vyroby-v-kaznejove/