Měření optické aktivity 4.1 Úvod (ukázky spekter) Přednáška 3 Měření optické aktivity 4.1 Úvod (ukázky spekter) 4.2 Metodika měření cirkulárního dichroismu 4.3 Elektronový cirkulární dichroismus Cirkulární dichroismus (CD) ~ rotační síla přechodu 𝑅 𝑖𝑗 Rot. síla přechodu je imaginární část skalárního součinu transitních dipólových momentů udává souvislost struktury molekuly, dané transitním elektrickým a magnetickým dipólovým momentem, a pozorovatelné veličiny – signálu CD: 𝑓 ~ 𝜈 𝑖𝑓 𝑖 ∆𝐴~ 𝑅 𝑖𝑗 =𝐼𝑚 𝜇 𝑓𝑖 ∙ 𝑚 𝑖𝑓 Rosenbergova rov. pozorovatelná veličina - CD struktura CH M 2016 přednáška 3

Měření optické aktivity 4.1 Úvod 𝑓 Měření optické aktivity 4.1 Úvod Ukázka spekter, hlavně spektra cirkulárního dichroismu (ostatní jako FDCD, ROA, ve zvláštních kapitolách) ~ 𝜈 𝑖𝑓 𝑖 CH M 2016 přednáška 3 2

Lukáš Palivec, 2003-05 Typické spektrum ECD elektronové přechody /L mol-1cm-1 absorpční spektrum obou enantiomerů totožné CD opačných enantiomerů se liší znaménkem větší spektrální rozlišení díky tomu, že CD má znaménko malé signály 10-3– 10-4 A /nm Lukáš Palivec, 2003-05 CH M 2016 přednáška 3

Lukáš Palivec, 2003-05 Typické spektrum VCD - VCD je více lokální fenomén, principiálně každá vazba v molekule je chromofor - VCD poskytuje velmi detailní informace, jěště zesíleno v ROA disymetrický faktor g= De/e Lukáš Palivec, 2003-05 CH M 2016 přednáška 3

(1S)-(-)-pinen (1R)-(+)-pinen Vladimír Setnička, 1999-2002 a-pinen – „standard“ VCD (nikoli chemometrický) (1S)-(-)-pinen (1R)-(+)-pinen Vladimír Setnička, 1999-2002

kombinace experimentu a ab initio výpočtu VCD reálný vzorek – prekurzor léčiva Bouř, Setnička, Navrátilová, …2003 CH M 2016 přednáška 3

kombinace experimentu a ab initio výpočtu ECD (time dependent density function theory TDDFT), vyžadují počítat vlnové funkce všech excitovaných elektronových stavů, které přispívají do ECD alkaloid schizozygine izolovaný z Schizozygia caffaeoides - tradiční medicína v Keni pro léčbu kožních nemocí Stephens, Pan, Devlin, Urbanová, Hájíček…2007

4.2 Metodika měření cirkulárního dichroismu Rysy společné ECD a VCD CD = AL – AR, nelze měřit postupně nejdřív AL pak AR a odečíst, proč? Koncept postupného měření signálu pro LCP a RCP se uplatňuje při měření Ramanovy optické aktivity (ROA) Měření CD jinak: připraví se střídavě LCP a RCP s vysokou frekvencí (typicky 50 nebo 37 kHz) a rozdíl response na LCP a RCP se měří ve fázově citlivém zesilovači (lock-in amplifier), takže vlastně zjišťujeme „synchronně“ přímo rozdíl responze na LCP a RCP normalizace na transmisi (děje jinak při ECD a jinak při VCD) PEM (photoelastic modulator) – v kombinaci s lineárním polarizátorem - vznik střídavého LCP a RCP: aplikací střídavého napětí se vyvolá střídavé mechanické napětí, periodické zpoždění dvou kolmých komponent mezi +l/4 a -l/4 a tedy střídavě LCP a RCP PEM pracuje při stavu své přirozené mechanické resonance, pracujeme bez podstatného uvolňování tepla Ondřej Julínek, 2006 přednáška 2/

Vznik chiroptického signálu a funkce PEMu Modulace stavu polarizace Modulace intenzity Z materiálu, který propouští (v IR CaF2, ZnSe) Aplikuje se tlak (vyvolaný piezolelektrickým elementem) Dvojlom (bi refringency) Indukuje se dráhový rozdíl v intervalu +l/4, -l/4 Střídavě LCR, RCL, 𝐼=𝑘𝑜𝑛𝑠𝑡, 𝐼~ 𝐸 2 Po průchodu opticky aktivním vzorkem se polarizační modulace mění na intenzitní modulaci – střídavý signál AC (alternating current) responze na nepolarizovaný signál je stejnosměrný signál DC (direct current) CD ~ AC/DC, dociluje je jinak v ECD a jinak ve VCD princip „synchronního“ měření AC a DC stejný v ECD i VCD, v komerčních i laboratorních spektrometrech Pozn. V PEM dochází k modulaci polarizace nikoli intenzity CH M 2016 přednáška 3

𝐼= 𝐼 0 10 − 𝐴 𝑅 + 10 − 𝐴 𝐿 2 + 𝐼 0 10 − 𝐴 𝑅 − 10 − 𝐴 𝐿 2 sin 𝛼 Vznik signálu dichroismu a funkce PEMu 𝐼 𝐼 0 = 10 −𝐴 𝐼= 𝐼 0 10 −𝐴 𝐼= 𝐼 0𝑅 10 − 𝐴 𝑅 + 𝐼 0𝐿 10 − 𝐴 𝐿 𝐼 0𝐿 + 𝐼 0𝑅 = 𝐼 0 𝐼 0𝐿 =( 𝐼 0 2)(1− sin 𝛼) 𝐼 0𝑅 =( 𝐼 0 2)(1+ sin 𝛼) 𝛼= 𝛼 0 sin 𝜔 𝑀 𝑡 𝐼= 𝐼 0 10 − 𝐴 𝑅 + 10 − 𝐴 𝐿 2 + 𝐼 0 10 − 𝐴 𝑅 − 10 − 𝐴 𝐿 2 sin 𝛼 𝐼 𝐴𝐶 𝐼 𝐷𝐶 tabule 𝐼 𝐷𝐶 𝐼 𝐴𝐶 𝐼 𝐴𝐶 𝐼 𝐷𝐶 =2 𝐽 1 𝛼 0 1,15( 𝐴 𝐿 − 𝐴 𝑅 ) 𝑔 𝐴 𝐿 − 𝐴 𝑅 =∆𝐴~ 𝐼 𝐴𝐶 𝐼 𝐷𝐶 faktor se získá kalibrací CH M 2016 přednáška 3

- propustnost materiálů - mechanické vlastnosti Rysy společné ECD a VCD Spektrální oblasti použitelné pro CD měření jsou obvykle užší než v mateřských spektroskopiích, větší nároky na : - propustnost materiálů - mechanické vlastnosti užší spektrální citlivost chlazených rychlých polovodičových detektorů (VCD), u ECD detektorem je fotonásobič absorpce nesmí být velká ani malá: příliš velká – nedostatek světla dopadajícího na detektor, příliš malá – relativně velký šum, optimální A = 0,6-0,8 Jevy, na které je CD citlivá: - dvojlom - doprovodné nechtěné polarizace při odrazech, k nim dochází všude na optických prvcích na oknech kyvet apod. Tyto jevy spektrálně citlivé a způsobují falešné signály pozorované jako artifakty Stálý požadavek ověřování reality CD signálů Formulace a dodržování měřícího protokolu Celé série měření provádět za stejných podmínek (rozbitá kyveta – zkreslení výsledků) přednáška 2/

4.3 Elektronový cirkulární dichroismus ve viditelném oboru lze sledovat jen molekuly obsahující chromofory (barevné látky), nebo pak v UV oboru (UV chromofory) rozšířená technika využívaná v biochemii vůbec nejčastější aplikace ECD je sledování sekundární struktury proteinů, a různých časových jevů folding a unfolding Pozn. intrinsic (vlastní) chiralita – často slabá optická aktivita (CD), „topologická“ chiralita - chiralita z prostorového uspořádání chirálních či achirálních jednotek, je často doprovázena výraznější optickou aktivitou (aminokyselina, dipeptid, oligopeptid, protein) DNA, telomery interakce polypeptidů a DNA s ligandy indukované CD (ICD) „malé“ chirální molekuly nanotechnologiích (topologická chiralita) studium samoskladných systémů chirálních rozpoznávání Historické poznámky:

Schéma optické a elektronické části ECD spektrometru Xenonová lampa dvojitý hranolový monochromátor se současnou polarizační funkcí polarizace vyladěna soustavou křemenných destiček („Filter“) systém štěrbin PEM: napětí vložené na PEM je optimalizováno tak, aby vznikala čtvrtvlnná destička pro všechna l (neděje se tak ve VCD) detektor je fotonásobič (photomultiplier, PM, photomultiplier tube, PMT) elektronika – zpětná vazba „feedback“ zajišťující konstantní DC signál (neděje se tak ve FT VCD) zvyšování napětí na PM – úměrné absorbanci vzorku, měří se „absorpční spektrum“ lze měřit jen do určitého napětí na PM 𝐼 𝐴𝐶 𝐼 𝐷𝐶 =2 𝐽 1 𝛼 0 1,15( 𝐴 𝐿 − 𝐴 𝑅 ) 𝑔 CH M 2016 přednáška 3

Spektrometr ECD 165 -1100 nm, nejčastěji 180 - 700 nm disperzní spektrometry (scanning) obdobné jednopaprskovým absorpčním spektrofotometrům hranol, proč: lineární disperzi ve vlnových délkách optimalizované na velkou světelnou propustnost (throughput) využívá se polarizace odrazem disperzní funkce kombinovaná s polarizací (Brewsterův úhel) Fotonásobič – „absorbance“ prostřednictvím napětí na fotonásobiči (udává se jako HT – high tension, velké napětí, malý proud) CH M 2016 přednáška 3 14

Praktické poznámky Požadavky na vzorek homogenní: kapaliny, pravé roztoky, kontrola centrigugací pevné látky: amorfní lze, vždy ale kontrola, zda se neměří artefakty (velký japonský projekt měření ECD pevných látek – řešitelka Kuroda) nejdřív zjistit jednopaprskovou absorpci (podstatná je celková transmitance, tj. absorpce vzorek + rozpouštědlo), je-li A>2 => změna kombinace koncentrace, tloušťka kyvety, rozpouštědlo Významná absorpce rozpouštědla (pufru) – neužitečné spotřebování světla (obr. tabule) Pozn. Je poloviční tloušťka kyvety a dvojnásobná koncentrace vzorku z hlediska měření výhodná? Jaké jevy neumožňují tuto výhodu využít? Kyvety materiál kyvet s malým dvojlomem, izotropní konvenční křemenné pravoúhlé (Hellma), materiál QS (QX) Quartz, propustnost >80% pro l > 200-2500 (3500) nm vhodné pro teplotní záv. Veškeré světlo musí procházet vzorkem, žádné reflexe na stěnách, kapalinovém menisku apod., pozor na „zúžené“ kyvety, nutno použit clonu a testovat jednorázové plastové kyvety se neosvědčují kyvety běžného tvaru – tl. 50-0,5 mm, nejčastěji 1 a 10 mm, skládané kyvety 5-500 mm 15

Praktické poznámky Vlastní měření měření v atmosféře N2, průtok volit podle oblasti měření podle manuálu, přítomný kyslík aborbuje a mění se průchodem UV záření na ozon – nezdravý a ničí zrcadla rychlý „scan“ pro určení parametrů měření měří se současně napětí na fotonásobiči, které je úměrné absorpci měří se v oblasti absorpce a jejím okolí ( asi 20 nm) Parametry měření: Časová konstanta (time constant) t (= doba, kdy přístroj „průměruje“ data rychlost záznamu (scan speed) s, šířka pásů (bandwidth) b Mělo by být: t . s <= b/2 S/N ~ (t . n . I0)1/2 CH M 2016 přednáška 3 16

Praktické poznámky Korekce na nulovou linii Nejlepší CD nulová linie, tzv. „baselina“- racemát o stejné absorbanci jako vzorek často se baselina získá jako ECD rozpouštědla ve stejné kyvetě, naprosto stejné podmínky jako pro měření vzorku, vždy měřit nulovou linii, zahrnuje přístrojovou a „vzorkovou“ nulu V případě malých signálu se může stát, že CD není nulové vně absorpčních pásů, mělo by být alespoň rovné, jinak je něco špatně Fluktuace baseliny: krátkodobé (ms – min) a dlouhodobé (min – h), lépe více akumulací, měřit „čerstvé“ nulové linie Vyhlazování NEDOPORUČUJE SE, je možné použít jen po dlouhodobé zkušenosti, ověřování, zdali se informace nezkresluje, ve speciálních případech Údržba nutno proplachovat kvalitním dusíkem, pak většinou stabilní výměna lampy (asi 800 h), vhodné zaznamenávat průběh H.T. na fotonásobiči při specifických parametrech (např. 200-300 nm, 2 nm bandpass). Uchovávat stejný záznam pro novou lampu, též důležité pro posouzení stavu zrcadel) výměna zrcadel po několika letech CH M 2016 přednáška 3 17

Praktické poznámky Standardy ammonium d-l0-camphorsulfonate and d-10-camphorsulfonic acid( (ACS and CSA, well defined band at around 290.5 nm and opposite intensity band at 192 nm. ACS is easier to handle since less deliquescent and it’s the standard supplied with Jasco instruments: a 0.06% aqueous solution (60mg in 100ml) of d-10-camphorsulfonate in a 10mm cell should give a signal of +190.4 mdeg ([Θ]290.5 = +7910) (1S)-(+)-10-camphorsulfonic acid (CSA) FW 232.30 [α]D 20 +19.9° c2, H2O [Θ]291 = +7820 available from Aldrich C210-7 or from Sigma C-1395 (1R)-(-)-10-camphorsulfonic acid (CSA) 20 -21° c2, H2O [Θ]291 = -7820 Aldrich 28,214-6 (1R)-(-)-10-canphorsulfonic acid, ammonium salt (ACS) FW 249.33 [α]D 22 -18.4° c=5.3, H2O [Θ]290.5 = -7910 Aldrich 18,836-0 (1S)-(+)-10-camporsulfonic acid, ammonium salt (ACS) 25 +20.9° c=6, H2O [Θ]290.5 = +7910 available from Katayama Chemical, it can be ordered directly from Jasco 18

*OD (optical density) je totéž co absorbance Praktické poznámky Rozpouštědla a pufry *OD (optical density) je totéž co absorbance Table 1: Solvent Transparency Compound Wavelength (nm) for OD*= 1.0 1.0-mm Path Length 0.05-mm Path Length H2O 182 176 MeOH 195.5 184 F6iPrOH 174.5 163 F3EtOH 179.5 170 EtOH 195 186 MeCN 185 175 Dioxane 231 202.5 Cyclohexane 180 175 α-Pentane 172 168 CH M 2016 přednáška 3

Table 2: Absorbance of Various Salt and Buffer Substances in the Far-UV Region Compound pH No Absorbance Absorbance of a 10 mM solution in Above a 1.0 mm Cuvette at: 210 nm 200 nm 190 nm 180 nm NaClO4 170 nm 0 0 0 0 NaF, KF 170 nm 0 0 0 0 Boric Acid 180 nm 0 0 0 0 NaCl 205 nm 0 0.02 >0.5 >0.5 Na2HPO4 210 nm 0 0.05 0.3 >0.5 NaH2PO4 195 nm 0 0 0.01 0.15 Na Acetate 220 nm 0.03 0.17 >0.5 >0.5 Glycine 220 nm 0.03 0.1 >0.5 >0.5 Diethylamine 240 nm 0.4 >0.5 >0.5 >0.5 NaOH pH 12 230 nm >0.5 >2 >2 >2 Boric Acid, NaOH pH 9.1 200 nm 0 0 0.09 0.3 CH M 2016 přednáška 3

Table 2: Absorbance of Various Salt and Buffer Substances in the Far-UV Region Compound pH No Absorbance Absorbance of a 10 mM solution in a 1.0 mm Cuvette at: Above 210 nm 200 nm 190 nm 180 nm Tricine pH 8.5 230 nm 0.22 0.44 >0.5 >0.5 TRIS pH 8.0 220 nm 0.02 0.13 0.24 >0.5 HEPES pH 7.5 230 nm 0.37 0.5 >0.5 >0.5 PIPES pH 7.0 230 nm 0.2 0.49 0.29 >0.5 MOPS pH 7.0 230 nm 0.1 0.34 0.28 >0.5 MES pH 6.0 230 nm 0.07 0.29 0.29 >0.5 Cacodylate pH 6.0 210 nm 0.01 0.20 0.22 CH M 2016 přednáška 3 21

2.4 Vibrační cirkulární dichroismus CH M 2016 přednáška 3