Zjištění molekulární hmotnosti zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP)
Polyakrylamidový gel a elektroforéza (PAGE) Zjištění molekulární hmotnosti zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP)
1.Příprava vzorků pro elektroforézu v polyakrylamidovém gelu (PAGE) Úkol 1: Zkontrolujte, jestli zkumavka (P) v UV-záření zeleně fluoreskuje!
1.Příprava zkumavky pro PAGE 1.1 Napipetuj 10 µl nanášecího pufru (Lämmli pufr) do vaší zkumavky (P). 1.2Zamíchej obsah zkumavky(P).
2. Příprava gelových kazet. 2.1 Otevři sáček s PAGE-gelem v místech vyznačených černou čárou a vyjmi gelovou kazetu.
2.2Odřízni skalpelem (nebo žiletkou) vyznačenou pásku na kazetě a stáhni spodní pruh. 2. Příprava gelových kazet
3.1 Vlož gelovou kazetu do elektrodového držáku kratší stranou dovnitř. Na druhou stranu stojanu dej další gelovou nebo prázdnou kazetu, také kratší stranou dovnitř. 3.2 Přesuň elektrodový držák s kazetami do upínacího rámečku se svorkami, upevni svorky. 3.3Vlož upínací rámeček do elektrodové vany. 3.4Vytáhni hřebínek. 3. Příprava komory pro elektroforézu
4.1Do komory mezi skly v elektrodovém držáku nalij TGS-pufr (elektrodový pufr) - až po okraj. 4.2Naplň elektrodovou vanu 200 ml TGS-pufru. 4. Naplnění komory pufrem.
Proteinový standart Kaleidoskop Proteinový standart Kaleidoskop Vzorek 5. Naplnění gelových jamek (levá a pravá jamka zůstane prázdná!) Jamky v gelu naplň: - 15 µl proteinového standartu Kaleidoskop (K) µl vzorku ze zkumavky (P).
6.1Zavři elektroforetickou aparaturu a zapni elektroforézu na 200 V. 6.2Zastav elektroforézu, jakmile bromfenolová modř doputuje ke spodnímu okraji gelu. 6. Provedení elektroforézy
7.1Vyjmi upínací rámeček s komorou a přelij pufr do elektroforetické vany. 7.2Sejmi gelovou kazetu. 7. Sejmutí gelu
8. Analýza 8.1Vložením pod zdroj UV-záření zviditelni GFP-pruh.
ColourkDa Blue250 kDa Violet150 kDa Blue100 kDa Magenta75 kDa Blue50 kDa Green37 kDa Magenta25 kDa Blue20 kDa Blue15 kDa Yellow10 kDa Schéma: Molekulární hmotnosti Standartu Kaleidoskop 8. Analýza 8.2Urči molekulární hmotnost GFP pomocí standartu Kaleidoskop