Zlepšování podmínek pro výuku technických oborů a řemesel Švehlovy střední školy polytechnické Prostějov registrační číslo : CZ.1.07/1.1.26/

Nepřímá metoda stanovení počtu buněk = kultivační Autor: Ludmila Trunečková

Nepřímá metoda stanovení počtu buněk = kultivační Je nejčastějším způsobem počítání buněk mikroorganismů pomocí kultivace je počítání kolonií vyrostlých na agarových plotnách. Princip: Metoda vychází ze základního empiricky ověřeného předpokladu, že z 1 životaschopné buňky vyrůstá 1 kolonie. Pojmem "životaschopnost" se v tomto případě rozumí schopnost buňky vytvářet na agarovém živném mediu viditelné makroskopické kolonie. Video: skladame-se-z-bakterii/obsah/ experiment-zivotaschopnost-kvasinek /

Zaočkování inokula do agarového média je možno provádět dvěma způsoby 1) očkováním inokula (nejlépe v objemu do 0,5 ml) na předsušené agarové plotny a jeho rozetřením sterilní hokejkou. 2) zalitím potřebného objemu inokula (nejčastěji 1 ml) vytemperovaným agarem a důkladným rozmícháním.

Pracovní postup 1) Ředění bakteriální kultury 2) Očkování a kultivace 3) Počítání vyrostlých kolonií a stanovení počtu buněk

1) Ředění bakteriální kultury Používá se k tomu, aby na povrchu živného média vyrůstaly jednotlivé kolonie. Nejčastěji se používá koeficient ředění 10. Jako ředidla se používají:  sterilní fosfátový pufr,  fyziologický roztok,  destilovaná voda.

Postup ředění bakteriální kultury 1) Připraví se řada sterilních zkumavek s 0,9 ml sterilního ředidla. 2) Ze vzorku se sterilně odebere 0,1 ml suspenze a přenese se do první zkumavky → získáme ředění 1: 10 (10 ⁻¹). 3) Čistou pipetou se nejprve promíchá obsah první zkumavky, a potom odebere 0,1ml, která se přenese do druhé zkumavky → získáme ředění 1: 100 (10 ⁻²). 4) Další čistou pipetou se opět nejprve obsah druhé zkumavky promíchá a pak odebere 0,1 ml do třetí zkumavky → získáme ředění 1: 1000 (10 ⁻³). 5) Stejným způsobem se pokračuje až do konečného zředění.

Ředění bakteriální kultury Konečné ředění = ředění, kdy po naočkování 0,1 ml (1 ml) ředěné suspenze na Petriho miskách o průměru 10 cm vyrostlo 20 – 200 kolonií. Všechny kroky ředění je nutno provádět sterilně.

2) Očkování a kultivace 1) Očkujeme na předem připravené a popisovačem označené plotny s MPA (u stanovení specifických skupin mikroorganismů na příslušné jiné médium, např. Endo-agar). 2) Očkujeme 0,1 ml suspenze na 1 misku, vždy alespoň 3 misky od každého ředění. 3) Napipetovaný vzorek se roztírá sterilní hokejkou krouživým pohybem po celém povrchu misky. Dnem misky se otáčí v opačném směru a na hokejku se netlačí. 4) Při pipetování i "hokejkování" otvíráme misky co nejméně. 5) Pro kontrolu sterility naočkujeme na 2 misky po 0,1 ml ředicího roztoku. 6) Kultivujeme v termostatu při 30°C 2-3 dny, misky pokládáme dnem vzhůru.

3 ) Počítání vyrostlých kolonií a stanovení počtu buněk 1) K hodnocení vybereme nejvhodnější ředění ( kolonií na misce). 2) Spočítáme počet kolonií na všech miskách tohoto ředění. 3) Počítané kolonie si označíme na spodní stranu misky fixou. 4) Ze získaných hodnot spočítáme průměr, číslo vynásobíme ředěním a 10 ti (pipetovali jsme 0,1ml na misku).

Fknt%2Fweb%2Findex.php%3Foption%3Dcom_docman%26task%3Ddoc_download%26gid%3D170%26Itemid%3D36&ei=P8uLUrjrMtTX7Aae7ID ACw&usg=AFQjCNHchadx3IyAq9LflCXDUKX_0ucUPw&sig2=Di5HWLAp9E5P2SrZ3wk7hw

Počítání vyrostlých kolonií a stanovení počtu buněk Příklad Na třech Petriho miskách s ředěním 10⁻⁵ vyrostlo: 75, 68, 85 kolonií. Aritmetický průměr ze 3 misek je 76. Výpočet: ⁻⁵. 10 = 7,6.10⁻⁷ CFU/ml Počet buněk se uvádí jako CFU = colony forming units v 1ml, protože ne vždy reprezentuje 1 kolonie 1 buňku, některé buňky jsou dočasně spojeny a vyrůstá z nich pak 1 kolonie.

Použití v potravinářském průmyslu, ve zdravotnických zařízeních, při sledování mikrobiologické čistoty vody, při sledování mikrobiologické čistoty vzduchu, při sledování mikrobiologické čistoty provozního zařízení, čistoty obalů.

Zdroje Veselá, M., Drdák, M.: Praktikum z obecné mikrobiologie, 1999, VUT Brno

Děkuji za pozornost !