Imunochemické metody Metody využívající vazbu mezi antigenem a protilátkou Vytášek 2008

Vazba mezi antigenem a protilátkou Je nekovalentní a podílí se na ní vodíkové můstky a iontové interakce stejně jako van der Waalsovy síly či interakce dipol-dipol Sílu interakce (vazby) mezi antigenem a protilátkou vyjadřuje afinitní konstanta K A = [Ab-Ag] / [Ab].[Ag] Afinitní konstanta, tj. síla vazby, je závislá na pH, iontové síle, přítomnosti detergentů či chaotropních činidel

Hlavní imunochemické metody 1)Imunoeseje 2)Imunoblotování 3)Imunoprecipitace 4)Imunoafinitní chromatografi 5)Imunosensory

Imunoeseje Princip metody je založen na přidání malého množství značené protilátky nebo antigenu k studované směsi antigen-protilátka a stanovení této značené komponenty ve výsledném imunokomplexu. Množství značené komponenty v imunokomplexu je závislé na koncentracích výchozích neznačených komponent. Nezbytnou podmínkou využití těchto metod pro analýzu antigenů je, aby antigen byl rozpustný v pufru zhruba fysiologického pH, osmolarity a bez detergentů rušících vazbu antigen-protilátka.

Imunoeseje Dle provedení : Homogenní Heterogenní – jedna z komponent (Ag nebo Ab) je navázána na pevnou fázi Dle značení : Značení radioisotopem (RIA) Značení enzymem (EIA) Značení fluoreskujícími barvičkami Značení přímé Značení nepřímé – často využívané pro značení protilátky (primární protilátka je neznačena a pak se použije druhá protilátka,která je druhově specifická a nese značku (tento typ značené protilátky je běžně komerčně dostupný)

Imunoesej s ukotveným antigenem V základní podobě se využívá pro stanovení specifických Ab proti ukotvenému antigenu (obvykle s nepřímým značením)

Imunoesej s ukotvenou protilátkou

Sandvičová imunoesej

Opláchnutí a inkubace se sekundární protilátkou vhodně značenou (enzymem či radioisotopem) Stanovení antigenu kompetetivní EIA s ukotveným antigenem

Koncentrace antigenu Kompetetivní EIA na ukotveném antigenu

Imunoblotování (Western blotting) kombinuje separační účinnost gelové elektroforesy se specifitou detekce na basi vazby antigen-protilátka semikvantitativní metoda umožňuje sledovat i antigeny nerozpustné v běžných pufrech

Imunoblotování – princip metody separace jednotlivých vzorků gelovou elektroforesou (obvykle SDS-PAGE) přenos rozdělených polypeptidů z gelu na vhodnou membránu (nitrocelulosu) blokování nespecifických vazebných míst membrány inkubace membrány se specifickou protilátkou (primární protilátkou) inkubace s druhou protilátkou vhodně značenou (tzv. sekundární Ab) proti imunoglobulinům zvířecího druhu primární protilátky detekce specifických antigenů pomocí značení

Mapování epitopu. Imunobloty tryptických štěpů COMP 0 mmol/l Ca 2+ 0°C, 30 min 12.5 mmol/l Ca 2+ 37°C 6hod12.5 mmol/l Ca 2+ 0°C, 30 min

Densitometrické hodnocení imunoblotů COMP ze synoviální tekutiny s třemi různými monoklonálními protilátkami

Tvorba precipitujícího imunokomplexu

Heidelbergerova precipitační křivka

Imunosensory princip je podobný heterogenní EIA, ale stanovení imunokomplexu se provádí bez značené komponenty měřením elektrických či optických změn na sensoru s navázaným imunokomplexem QCM (quartz crystall microbalance) - pokles frekvence oscilátoru s křemenným krystalem je úměrný hmotě navázané na povrch křemenného krystalu SPR (surface plasmon resonance) - optického jev vznikajícího na tenkých vrstvách nebo na nanočásticích je úměrný celkové adsorbované hmotě na povrchu tenké vrstvy či nanočástic