1 Metody molekulární biologie ve forenzní genetice Jana Vlasáková

2 Úvod Molekulární biologie 50. léta 20. století Hraniční obor mezi biologií a chemií Teoretické i metodické poznatky přírodních věd Bílkoviny a nukleové kyseliny Forenzní genetika Kategorie soudní DNA Další obory (biomolekulární archeologie)

3 Historie genetiky I 1865 – Johann Gregor Mendel Pokusy s hrachem setým (Pisum sativum) Mendelovy zákony

4 Historie genetiky II 1953 – James D. Watson & Francis H. Crick Struktura DNA 1962 – Nobelova cena 2003 – oslavy 50. výročí objevu struktury DNA

5 Historie genetiky III 1984 – Alec Jeffreys DNA fingerprinting (genetický otisk) 1986 – metoda prvně využita v kriminalistice Případ vražd Lindy Mannové a Dawn Ashortové (Velká Británie) 1987 – odběry DNA, 4500 mužů z okolních vesnic (Colin Pitchfork) 1992 – prvně v ČR (Jana Krkošková)

6 Kriminalistická biologie Aplikovaná biologická věda Vyhledávání, zajišťování, zkoumání a vyhodnocování biologických stop Lidského, zvířecího nebo rostlinného původu

7 Druhy biologických stop Samovolně odloučený materiál Moč, pot, ejakulát, poševní sekret, vypadlé vlasy nebo chlupy Menstruační krev, plodová voda, placenta Materiál oddělený působením zevního násilí Krev, části tkání a orgánů, vytržené vlasy, části kostí Materiál ze zaniklého organismu Mrtvoly a jejich části, kosti a kosterní nálezy

8 Zajišťování biologických stop Nikdy se nedotýkat holou rukou Kontaminace vlastním biologickým materiálem Ohrožení vlastního zdraví (nebezpečí infekce) Zajištění celého předmětu Sejmutí z podkladového materiálu Ke zkoumání se zasílá materiál suchý Nejvhodnější obalový materiál – čistý papír Zajistit veškerý nalezený biologický materiál Zajištění srovnávacích materiálů

9 Nukleové kyseliny – informační biopolymery Biopolymer - biologická makromolekula, která vzniká v organizmech kondenzací z více stejných či různých nízkomolekulárních látek Nukleové kyseliny, proteiny

10 Druhy nukleových kyselin I DNA - deoxyribonucleid acid Jaderná, mitochondriální A, C, G, T Deoxyribosa Kys. Fosforečná dvoušrobovice

11 Druhy nukleových kyselin II RNA – ribonucleid acid Mediátorová, transferová, ribosomální A, U, G, C Ribosa Kys. Fosforečná jednořetězcová

12 Replikace Semikonzervativní replikace Semidiskontinuální průběh Kontinuální syntéza (5´->3´) Diskontinuální syntéza (Okazakiho fragmenty) DNA-helikáza DNA-polymeráza DNA-primer DNA-ligáza

13 Transkripce Probíhá podobně jako replikace Přepis DNA do RNA RNA-polymeráza RNA-primer Posttranskripční úpravy Sestřih (exony a introny)

14 Translace Překlad z RNA do proteinu mRNA, tRNA, rRNA

15 Izolace a extrakce DNA I Nutná enzymatická nebo mechanická degradace buněčných stěn Po lyzy buněk lze DNA oddělit centrifugací Fenol-chloroformová extrakce Rozrušení buněčné stěny Enzymy štěpící bílkoviny na aminokyseliny (proteáza) EDTA (chelatační činidlo, kys. etylendiaminotetraoctov á ) DTT (redukčn í činidlo proti oxidat. naru š en í DNA během izolace, dithiothretiole ) Přidání fenol/chloroform (cca 1:1)

16 Izolace a extrakce DNA II Vytřepáním a centrifugací se vytvoří fázové rozhraní Spodní část (organická fáze, nepolární látky) Střední část (mezifáze, bílkoviny) Horní část (vodná fáze, polární látky – DNA)

17 Izolace a extrakce DNA III Lyze buněk Centrifugace Přidání 5% suspenze Chelex® 100 Inkubace při 56°C (20-30 min) a denaturace při 100°C centrifugace

18 Izolace a extrakce DNA IV Postupy využívající fakt, že v přítomnosti solí zvyšujících iontovou sílu se volná DNA váže na silikát (polymerní SiO 2 – sklo) Vhodnost těchto metod pro extrakci z forenzn í ch a archeologických vzorků (extrakce velk é ho množstv í DNA a ú činná eliminace PCR inhibitorů) voln é elektron. p á ry na kysl í ku přitahuj í + nabit é ionty, kter é přitahuj í fosf á tov é skupiny DNA

19 Amplifikace DNA I Namnožení úseků DNA PCR (Polymerase Chain Reaction) Řízené kopírování DNA v laboratorních podmínkách Templátová DNA (vzorek k amplifikaci) Primery (krátké specifické úseky DNA) Volné stavební jednotky DNA (A, C, G, T) Termostabilní DNA-polymeráza (Taq, Pfu) PCR pufr a soli (KCl, MgCl 2 )

20 Amplifikace DNA II

21 Amplifikace DNA III PCR se provádí v termocyklerech Počet cyklů 25-35x

22 Elektroforéza Klasická metoda dělení fragmentů DNA DNA je kyselina – v H 2 O ochotně uvolňuje H + ze svých fosf á tových skupin, č í mž se st á v á z á porně nabitá V elektrickém poli putuje molekula DNA od – ke + elektrodě Pohyb v „ hust é m “ prostřed í (čím menší molekula DNA, t í m pohyblivěj ší gelov á (agaróza, polyakrylamid) a kapil á rn í elektrofor é za) Žebříček („ladder“) – standard k určení velikosti fragmentů DNA…

23 Analýza DNA I RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Princip spočívá ve využití úseků DNA s opakující se sekvencí nukleotidů Štěpení restrikčním enzymem Směs různě dlouhých fragmentů DNA Elektroforéza (rozdělí fragmenty podle velikosti) Aplikace sondy (krátký sled nukleotidů, značení radioizotopem)

24 Analýza DNA II Užití metody DNA-fingerprintingu při identifikaci osob S1, S2 – podezřelí; E - důkaz

25 Analýza DNA III STRP (Short Tandem Repeat Polymorphism) Dnes nejpoužívanější metoda Podobná metodě RFLP Nekódující místa tvořena opakováním krátkého motivu Mnohokrát opakovaný sled 2-4 nukleotidů (např. -CACG-CACG-CACG-) Podoba repetic a délka je individuální

26 Další využití metod molekulární biologie Biomolekulární archeologie Identifikace obětí havárií, přírodních katastrof, válečných konfliktů Určování paternity Detekce genů dědičných chorob