Zlepšování podmínek pro výuku technických oborů a řemesel Švehlovy střední školy polytechnické Prostějov registrační číslo : CZ.1.07/1.1.26/

Barvení v mikrobiologii Autor: Ing. Renata Grulichová

Barvení v mikrobiologii Barvení - je biochemická metoda, kterou se přidá k substrátu specifická barvící látka (barvivo) a slouží v biologii k prokázání výskytu (kvalifikaci) nebo množství (kvantifikaci) specifické látky ve zkoumané tkáni nebo v pletivu, nebo k obarvení celých struktur a objektů. Jednotlivé buněčné struktury nejsou v mikroskopu při pozorování bez předchozího zbarvení téměř rozlišitelné pro stejný nebo jen málo odlišný lom světla. Barvíme z důvodu lepšího zkoumání mikroorganismů. Před barvením se provádí fixace preparátu. Používají se syntetické anilinová barviva – obsahují chromoforové skupiny.

PRINCIP BARVENÍ Princip barvení: metodika jednoduchých (orientačních) barvení je založena zejména na afinitě (přilnavosti) barviv k bakteriální struktuře. Např. krystalová violeť barví snáze struktury, které neobsahují ve stěně mnoho nepolárních sloučenin

PRINCIP BARVENÍ ČÁSTICE BARVIVA KOVALENTNĚ VÁZANÉ V BAKTERIÁLNÍ STĚNĚ mikrobiologie.unas.cz/soubory/mikroskopie.pps

Druhy barviv 1. Kyselé barviva – barví buněčnou strukturu, cytoplasmu eukaryotických buněk. Příklad – eozin, tryptanová modrá, kyselina pykrová. 2. Zásaditá barviva – působí na bazofilní části buňky např. jádro. Příklad – fuchsín, safranin, krystalová violeť, malachitová zeleň. 3. Neutrální barviva – eozin, Azur II. 4. Mořidla – mají afinitu jak k barvenému objektu tak k i k barvivu, takže pomáhájí ve fixaci barviva v materiálu. Jsou to anilin, fenol, Lugolův roztok.

Metody barvení Orientační – jde o barvení, kdy používáme pouze jeden druh barviva, kterým znázorňujeme charakteristické znaky – tvar buněk, chemické složení. Diagnostické – jde o barvení, kdy používáme směsi roztoků. Umožňuje rozpoznat důležité vlastnosti např. grampozitivitu, acidorezistenci, přítomnost pouzder nebo spór.

Typy barvení 1. Vitální barvení 2. Negativní barvení 3. Barvení fixovaného preparátu – barvení pouzder, spor

Vitální barvení Je způsob, kdy je tkáň barvena za živa. Patří sem důkaz glykogenu, bílkovin, tuku. Mezi vitální barvení patří i vitální test, který se používá např. v pekařství při kontrole kvasinek. Mrtvé buňky se barví do modra, živé zůstávají neobarvené. Postup vitálního testu: 1) Do středu podložního skla přeneseme kapku metylenové modři a důkladně v ní rozetřeme kličku kultury kvasinek. 2) Preparát překryjeme krycím sklem a ihned pozorujeme. 3) Při zvětšení 10 x 45 počítáme zbarvené a nezbarvené buňky.

Negativní barvení Tvoří přechod mezi pozorováním nezbarvených živých organismů a fixovaným barveným preparátem. Metoda spočívá v obarvení pozadí, buňky zůstávají nezbarvené, jejich obrysy jsou orámovány barvivem. Používá se k mikroskopickému stanovení pouzder a slizů a k měření velikosti bakteriálních buněk, tedy v případech, kdy nemůžeme preparát fixovat, protože by došlo ke změně velikosti buněk a k deformaci pouzder.

Negativní barvení 1. Barvení nigrosinem (dle Burriho) Klička kultury bakterií se suspenduje v kapce vody na sklíčku a přidá se kapka nigrosinu. Rozmíchá se a pomocí druhého krycího sklíčka rozetře. Necháme uschnout volně na vzduchu. Nefixujeme! 2. Barvení Kongo-červení Na sklíčko se kápne kapka Kongo-červeně a přímo v ní se suspendují buňky. Suspenze se rozetře po povrchu sklíčka a nechá zaschnout. Převrstvíme na několik sekund HCl, slijeme, přebytečnou HCl (neoplachujeme), osušíme filtračním papírem a dosušíme na vzduchu.

Barvení pouzder Některé druhy bakterií tvoří za vhodných podmínek slizovité obaly kolem svých buněk. Jsou složeny především z polysacharidů, jsou silně hydratované a chrání buňku proti nepříznivým podmínkám. 1) Do kapky destilované vody na podložním sklíčku se přenese malé množství kultury Azotobactera z nahromaďovací půdy. 2) Promíchá se a suspenze se rozetře po povrchu sklíčka. Nechá se uschnout volně na vzduchu. Nefixovat! 3) Barvíme horkým karbolfuchsinem, kterým sklíčko převrstvíme a opatrně zahříváme nad plamenem do výstupu par, 1-2 minuty. 4) Opláchneme vodou a negativně obarvíme nigrosinem, který se kápne do rohu sklíčka a rozetře do tenké vrstvy. Rychle osušíme, např. vysoušečem na vlasy, aby se buňky neodbarvily.

Výsledek barvení pouzder Buňky jsou červené, pouzdra růžové a šedé pozadí. mikrobiologie.unas.cz/soubory/mikroskopie.pps

Wirtz – Conklinovy metoda – barvení spor Používá se k barvení spor (klidové formy bakterií). 1) Preparát zfixujeme běžným způsobem. 2) Barvíme při zahříváním nad kahanem Malachitovou zelení 3x-4x do výstupu par po dobu 5 min. Barvivo doléváme. Nesmí vyschnout úplně !!! 3) Opláchneme ve vodě. 4) Navrstvíme karbolfuchsin za normální teploty 1-3min. 5) Vysušíme mezi filtračním papírem 6) Prohlížíme imerzním systémem.

Výsledek barvení u Wirtz – Conklinovy metody Spory zelené, tělo bakterie červené. U starších kultur můžou být spory samostatně (vypadlé) mikrobiologie.unas.cz/soubory/mikroskopie.pps

Barvení podle Ziehl - Neelsena Je metoda. která se používá k průkazu tzv. acidorezistentních bakterií, konkrétně mykobakterií a nokardií a některých aktinomycet. 1) Preparát zfixujeme 3x protažením v plameni. 2) Přelijeme koncentrovaným Karbolfuchsinem 3-5 min 3) Odbarvujeme v kyselém alkoholu. 4) Opláchneme ve vodě. 5) Dobarvíme malachitovou zelení 0,5-1 min. 6) Opláchneme ve vodě. 7) Sušíme vysoko nad kahanem. 8) Pozorujeme imerzním systémem Prohlédnout alespoň 50 zorných polí !!!

Výsledek barvení podle Ziehl - Neelsena Acidorezistentní bakterie budou znázorněny červeně a zbytek bude zelený. mikrobiologie.unas.cz/soubory/mikroskopie.pps

Zdroje mikrobiologie.unas.cz/soubory/mikroskopie.pps d=3&ved=0CDcQFjAC&url=http%3A%2F%2Fwww.pf.jcu.cz%2Fs tru%2Fkatedry%2Fbi%2Fbt- barveni_mikroskopickych_preparatu.pps&ei=pF7JUqK7N8yh7Ab S4oAQ&usg=AFQjCNFADFlpkdcTGdkcDfgKZlGdtoJnjw Veselá, M., Drdák, M.: Praktikum z obecné mikrobiologie, 1999, VUT Brno

Děkuji za pozornost !