Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganismů Mgr. Petra Straková Podzim 2014

Hodnocení minulého cvičení  Půdy: 2. týden kultivace půdy s 3 druhy papíru (buničina, filtrační, noviny) - zhodnotit % rozkladu  Očkování mikroorganismů 1) očkování vpichem 2) tekutá půda – zákal 3) očkování na šikmý agar - hádek 4) očkování na pevnou půdu – křížový roztěr? Jasně viditelné rozdílné kolonie?  Kontaminace?

Dnes  Pozorování a popis kolonií  Pozorování bakterií v nativním a barveném preparátu

Proč barvení?  Další krok k identifikaci  1) pozorování kolonií a jejich morfologie  2) při barvení – barvitelné vs. nebarvitelné, typy a struktury  Kolonie = klon jedné buňky  Nejlépe pozorovatelné v místě „hádka“ při křížovém roztěru

Popis kolonií

Barvení, pozorování  Řada způsobů  Základ: Gram, negativní, nativní, acidorezistentní (Ziehl-Neelsen), Giemsa-Romanowski; barvení spor, pouzder, granulí, bičíků apod.  Pozorování: mikroskopie, pro bakterie - imerze (100x10); paraziti (40x10), viry – elektronový mikroskop  Fluorescenční mikroskop - barvení fluorochromy (fluorescein), imunofluorescence

Barvení  Určení: TVARU, STRUKTUR  Diagnostické znaky

Nativní preparát  Nebarvený, v kapce fyziologického roztoku či destilované vody  Skutečný tvar (nedeformovaná buňka barvením), pohyb, růst a množení  Postup: kapka dest.vody, do ní malé inokulum, přiklopit krycím sklíčkem (bez bublin) a pozorovat (bez imerze)  Pozorování – fázový kontrast

Barvený preparát  Princip: nanesení vzorku na sklíčko, fixace a barvení.  Popíšeme si podložní sklíčko (nálepka a tužka) - do kapky fyziologického roztoku resuspendujeme přiměřené množství biomasy z izolované kolonie, výsledná suspenze by měla být jen lehce zakalená  kapka se nechá zaschnout a fixuje se protažením podložního sklíčka plamenem (3x) NÁTĚREM NAHORU !!! = usmrcení bakterií a jejich přichycení k sklíčku  Vlastní barvení

Gramovo barvení  Nejčastější, nejjednodušší, slouží k primární identifikace – G+/G-  = rozdíl ve složení buněčné stěny !!!

Gramovo barvení  G+ - silná vrstva peptidoglykanu brání vymývání – FIALOVÉ  G- - slabá vrstva peptidoglykanu – průnik rozpouštědla – odbarvování – ČERVENÉ !!!  Co se neobarví? Bakterie bez BS (mykoplazmata), gram labilní - některé spirálovité bakterie (borelie) a silně acidorezistentní druhy (mykobakterie)

Gramovo barvení - postup  Krystalová violeť (30s)  Lugolův roztok (30s)  Etanol (aceton) (20s)  Safranin (karbolfuchsin) (60s)  V mezikrocích omýt vodou  Pozorování pod imerzí  Postup: nastavit si menší zvětšení a postupovat až k přidat imerzní olej

Gramovo barvení - postup

Acidorezistentní barvení  = Ziehl-Neelsen  Ve stěně až 30% lipidů (vosky, atd) – špatně absorbují barviva a musejí se barvit za horka (takto přijatá barviva se nedají odmýt ani velmi silnými rozpouštědly), barví se karbolfuchsinem a dobarvují se malachitovou zelení  Organismy – růžové, okolí - zelené  Např. mykobakterie, nokardie

Co byste měli vidět…  Escherichia coli - G- rovné tyčky, jednotlivě, peritrichální bičík  Pseudomonas sp. - G- rovné, mírně zahnuté tyčky, polární bičík  Serratia marcescens – G- rovná tyčka, peritrichální bičík  Kocuria rosea – G+ kok, po dvou, tetrády, shluky  Micrococcus luteus – G+ kok, po dvou, tetrády  Bacillus subtilis - G+ rovné tyčky, řetízky, spory !  Staphylococcus aureus – G+ koky, po dvou, shluky  Saccharomyces cerevisiae – velké, kulaté, eukaryota !!  PLEOMORFISMUS !

Úkol  Zkontrolovat misky, popsat kolonie  1. preparát s jedním druhem (z křížového roztěru)  2. preparát se směsí (z křížového roztěru, nebo směs 2 bakterií)  Pozorování pod mikroskopem -> poznamenat si tvar, strukturu, uspořádání