Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 3 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno tel.:

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 3 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno tel.:"— Transkript prezentace:

1 Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 3 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i. Královopolská Brno tel.: Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16 Particle Delivery: Hydrodynamic Focusing Intensity Count Narrow particle focus = Narrow distribution Laser Cross Sectional Area Sample core is ‘pinched’ by fast flowing sheath Sample volume ratios of 100 – 1000 Large ratios => low sample inputs Resolution of particle populations sheath Hydrodynamic core Conventional Instrumentation: Low Flow Rates (12µL/min)

17 Particle Delivery: Hydrodynamic Focusing Conventional Instrumentation: High Flow Rate (60µL/min) Intensity Count Broad particle focus = Broad distribution Increased sample input = increase core size Particle distributions broadened, CVs increase Instrument resolution decreased Historically, low volumetric sample rates used (25  l/min – 150  l/min) sheath Hydrodynamic core Laser Cross Sectional Area

18 Attune® Acoustic Focusing Cytometer

19 Acoustic Focusing = Better Precision Acoustic focusing Module sheath Narrow particle focus = Narrow distribution 12 µL/min 1000 µL/min Acoustic focusing of particles occurs prior to mixing with sheath fluid

20

21

22

23 laserdetectorfluorochrome 405 VL1450/50 Pacific Blue, Alexa Fluor 405, Brilliant Violet 421 VL2522/31 Horizon V500, LIVE/DEAD Aqua VL3603/48 LIVE/DEAD Yellow, Qdot BL1530/30 FITC, GFP, Alexa Fluor 488, Calcein, LIVE/DEAD Green, ALDEFLUOR, HiLyte 488 BL2574/26 PE, propidium iodide, Hilyte 555 BL3640 LP PerCP, Pe-Cy7, PerCP-eFluor 710, LIVE/DEAD Red, 7-AAD Attune (2 lasers, 6 detectors setup)

24 Attune - Key performance features include: Breakthrough acoustic technology that focuses cells or particles Highest sample delivery rates commercially available (up to 1,000 μL/minute) User-selectable collection rates Equipped with: Blue/Violet: 488 nm (20 mW) and 405 nm (50 mW) lasers 8 parameters—6-color detection plus side scatter and forward scatter User-changeable bandpass and dichroic filters Simplified fluorescence compensation Manual and automated compensation Adjustable PMT voltage settings Detection of up to 20,000 events/sec and 20 million events/file Calibrated delivery volumes for volumetric analysis and absolute cell counts Electronic resolution of 6 decades Low fluid consumption (about 1 L/day); self-contained fluids Countertop instrument—fits on standard lab bench or in laminar Software: No software licensing fees Output file format: FCS 3.0 Live gating with automatic saving User and administrator log-in

25 Cancer The Attune® Acoustic Focusing Cytometer, with its fast acquisition times and increased precision, overcomes the technological hurdles involved in analyzing CECs. Stem Cells Side Population Analysis In this study, we demonstrate the ability of the Attune® Acoustic Focusing Cytometer with the blue/ violet laser configuration to quickly analyze a large number of events in search of very rare populations of stem cells. Human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) Adult human mesenchymal stem cells (hMSCs) are rare fibroblast-like cells capable of differentiating into a variety of cell tissues, including bone, cartilage, muscle, ligament, tendon, and adipose. Cell Cycle Analysis Cell cycle analysis is just one example of an application in which precise detection of differences in fluorescence intensity between multiple cell populations is critical... Cell Proliferation Successful proliferation analysis by dye dilution requires sensitive instrumentation and an extremely bright dye to accurately distinguish fluorescently labeled cells from autofluorescence after several cell divisions... Marine Sample Analysis Flow cytometry is a powerful tool for studying the biology, ecology, and biogeochemistry of marine photosynthetic picoplankton... Immunophenotyping The Attune® Acoustic Focusing Cytometer exhibits excellent segregation of populations in immunophenotyping experiments (with up to 6 colors)... Apoptosis The Attune® Acoustic Focusing Cytometer is compatible with a broad offering of reagents and kits for flow cytometric apoptosis testing... GFP & RFP Detection Data for GRP and RFP detection were collected from the Attune® Acoustic Focusing Cytometer using human osteosarcoma cells (U2OS) and BacMam CellLight® reagents... Microbiological Applications In recent years the application of flow cytometry to the study of various microbiological phenomena has increased, finding utility in studies that include detection and quantification...

26 Example: Detecting human circulating endothelial cells using the Attune® Acoustic Focusing Cytometer Circulating endothelial cells (CECs) are mature cells shed from blood vessel walls during the natural process of endothelial cell turnover. Elevated levels of CECs have been reported in a host of pathological conditions including cardiovascular disorders, infectious diseases, immune disorders, post transplantation analysis, and cancer. CECs are reported to be present in very low numbers: 0.01%–0.0001% of all peripheral blood mononuclear cells

27 Maximum Sample Input Rate (  l/min) Instrument 1 Instrument 2 Instrument 6 Instrument 5 Instrument 4 Instrument 3 Attune® Attune® Throughput Compared to Hydrodynamic Focused Instruments Attune® can analyze at sample rates from 25µL/min to 1000µL/min without losing accuracy Traditional Flow Cytometers can only run at most 150µL/min and will sacrifice data quality Higher sample rates enable dilution of limited samples and analysis of Rare Events Faster Hydrodynamic Focused Instruments

28

29 Attune souhrn Výhody: rychlost měření jednoduché ovládání sw licence bez omezení snadná výměna emisních filtrů nízká spotřeba nosné kapaliny (cca 1L denně) Limitace: jen dva lasery (6 barev) pouze originální roztoky dlouhý (i když automatický) shutdown sw nedokáže importovat FCS data nutnost nastavit určitý akviziční objem vzorku

30

31 tlak nosné (oplašťující) kapaliny vede pufr kyvetou a vyšší tlak ve zkumavce se vzorkem zavádí vzorek do kyvety. Princip hydrodynamického zaostření zarovná buňky v kyvetě „jako perly na šňůrce“ předtím než dojdou do bodu kde protnout paprsek laseru. Hydrodynamické zaostření nemůže oddělit buněčné agregáty. Průtoková cytometrie vyžaduje suspenzi jednotlivých buněk! Fluidika – shrnutí 2

32 Image Stream & Flowsight Amnis – kombinace průtokové cytometrie a analýzy obrazu

33

34 Amnis - aplikace

35 Principy průtokové cytometrie a sortrování sorting zpracování signálu analýza dat kompenzace signálu K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54 SORTING

55 Frequency Charge Drop Delay Amplitude SORTING

56 Sheath Pressure Nozzle Size Frequency Amplitude

57 SORTING Drop delay Interrogation point Breakoff

58 SORTING Each sort setup includes: Sheath pressure Breakoff window values Side Stream window values Instrument window > Laser tab values

59 SORTING - Streams GoodBad

60 SORTING – Setup Side Streams

61 Drop Delay interrogation point drop delay breakoff Waste BD FACS™ Accudrop technology Accudrop beads Diode laser Camera Optical filter

62 Sorting - Sort Masks Cells are randomized distributed over the stream

63 Sorting - Sort Masks Trailing Interrogated Leading

64 Mask A region of the stream monitored for the presence of cells Determines how drops will be deflected if a sorting conflict occurs Measured in 1/32 drop increments Mask = 0Mask = 8Mask = 16Mask =

65 Conflict Resolution Precision modes include three types of masks –Yield –Purity –Phase

66 Sorting - Sort Masks Sort decisions are determined by sort masks Target particles in a drop with 1/32-drop resolution

67 Sorting - Yield Mask The yield mask defines how many drops will be sorted Yield mask of 8/32 indicated in blue; target particle shown in green Yield Mask

68 Sorting - Purity Mask Purity mask of 8/32 in blue, 4/32 in each adjacent drop; target particles in green, non-target particles in red Purity Mask

69

70

71 Laser Laser Laser Creation of a Voltage Pulse Time Voltage Time Voltage Time Voltage 1 2 3

72 Height, Area, and Width Time (µs) Vol tage Pulse area(A) Pulse Height (H) Pulse Width (W) 0

73 Signal processing time analog signal intesity VOLTAGE FSC ~ cell size FL-1 (530/30nm) ~ green fluo. FL-2 (585/42nm) ~ red fluo. Analog/digital conversion Height Width Area ( ∫ ) FL- (H, W, A) FL-1 (H) FL-2 (H) dot plot Zesílení signálu (!) lin nebo log K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

74 74 baselin e 16, 364 Time Analog to Digital Converter

75 75 Voltage In PMT Power Supply Levels 0–1000 Volts Photon In Signal Out Digital data to memory Analog to Digital Conversion Conversion Digitize the pulse 16,384 levels Sample the pulse 10 MHz Analog to Digital Converter

76 76 Parameters Area:Sum of all height values Height:Maximum digitized value X 16 Width:Area/Height X 64K Data is displayed on 262,144 scale

77

78

79

80 2 4 =16

81 Lineární a logaritmický obvod lineární logaritmický kompenzace fluorescenčního signálu

82 AD převodníky Počet bitů# kanálůrozlišení mV mV mV  V  V  V  V  V nV 2 8 = = Full scaleFull scale measurement range = 0 to 10 volts ADC resolution is 12 bits: 212 = 4096 quantization levels ADC voltage resolution is: (10-0)/4096 = volts = 2.44 mV K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

83 Kolik bitů? Pokud konvertujeme analogový signál pomocí 8 bitového ADC – máme 256 kanálů (2 8 =256) odpovídajících rozsahu 0-10 V Rozdíl mezi kanály je 10/256=~40mV V 1V 100mV Channels upraveno podle J.P.Robinson

84 Ideální logaritmický zesilovač V 1 V 100 mV V1 mV Channels Linearní Log 1 V100 mV10 mV Log amp upraveno podle J.P.Robinson

85 Logaritmické zesílení & dynamický rozsah upraveno podle J.P.Robinson lin log

86 Kompenzace fluorescenčního signálu …později

87 Analýza dat Zobrazení dat –histogram –dot plot –isometric display –contour plot –chromatic (color) plots –3 D projection Gating

88 Způsoby pro zobrazení dat K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

89 Histogram distribuce četnosti Histogram zobrazuje četnost částic pro jeden parametr Jednoduchý výstup Nekorelujeme s dalším parametrem Problém s identifikací populací K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

90 Dot plot Zobrazuje korelaci dvou libovolných parametrů Jednotlivé tečky představují konkrétní změřené buňky (částice) Hodnoty pro řadu částic mohou ležet ve stejném místě Nemáme informaci o relativní denzitě částic Problémy s vykreslením v případě velkých objemů dat K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

91 Density & contour plot Density plot: Zobrazuje dva parametry jako frekvenci četnosti barva a nebo její odstín odpovídá četnosti částic Contour plot: spojnice spojuje body (částice) se stejnou hodnotou signálu V podstatě simulujeme 3D graf – třetí rozměr je frekvence K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

92 Čas jako jeden z parametrů K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

93 3D zobrazení 2 parametry + četnost 3 parametry společně K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

94 3 Color Combinations Negatives Positives 4+4=8 FITC PE APC 4+4+4=12 upraveno podle J.P.Robinson

95 3 Color Combinations FITC PE APC 4+4+4=12 upraveno podle J.P.Robinson

96 „Gating“  Real-time gating vs. softwarový „gating“  Určení regionů  Strategie „gatingu“  Analýza kvadrantů  Boolean „gating“  zpětný „gating“

97 Real-Time vs. Software Gating  Real-time (live) gating: -omezuje akceptovaná data během měření  Software (analysis) gating: -vyřazuje určitá data během následné analýzy upraveno podle J.P.Robinson

98 Určení regionů  Objektivní nebo subjektivní? -školení/schopnosti/trénink  Možné tvary: -obdelník -elipsa -“free-hand“ (polygon) -kvadrant  Statistika - počet - podíl (%) - průměr, medián, S.D., CV, ….

99 Region vs. gate Region  oblast (plocha) v grafu definovaná uživatelem  mnoho regionů v jednou grafu  ohraničujeme pomocí nich populace našeho zájmu  je možné je barevně odlišit  je definován stejně pro všechny vzorky v analýze Gate  je definován jako jeden a nebo více regionů zkombinovaných pomocí logických operátorů (AND, OR, NOT; Booleova logika) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

100 Region 1 established Gated on Region 1 Using Gates log PE upraveno podle J.P.Robinson

101 Statistika Aritmerický průměr Geometrický průměr Medián – odhad střední hodnoty – není ovlivněn extrémními hodnotami Směrodatná odchylka Koeficient variance Modus – nejčastější hodnota K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

102 Statistika pro histogram K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

103 Analýza kvadrantů (+ +)( - +) (+ -) (- -) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

104 Logický „Gating“ (Booleova logika) S překrývajícími se oblastmi máme mnoho možností: upraveno podle J.P.Robinson

105 Boolean Gating Not Region 1: upraveno podle J.P.Robinson

106 Boolean Gating Not Region 2: upraveno podle J.P.Robinson

107 Boolean Gating Region 1 or Region 2: upraveno podle J.P.Robinson

108 Boolean Gating Region 1 and Region 2: upraveno podle J.P.Robinson

109 Not (Region1 and Region 2): Boolean Gating upraveno podle J.P.Robinson

110 90 Degree Scatter Lymphocytes Monocytes Neutrophils Side Scatter Projection Light Scatter Gating Scale upraveno podle J.P.Robinson

111 Back Gating Region 4 established Back-gating using Region 4 log PE Back gate Back gate upraveno podle J.P.Robinson

112 Back Gating K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

113 FITC + PE+ FITC+ APC+ PE + APC+ 3 Parameter Data Display upraveno podle J.P.Robinson

114 Vícebarevné analýzy generují mnoho dat… color 4 color 5 color upraveno podle J.P.Robinson

115

116 Detection and monitoring of normal and leukemic cell populations with hierarchical clustering of flow cytometry data Cytometry Part A Volume 81A, Issue 1, pages 25-34, 11 OCT 2011 DOI: /cyto.a Volume 81A, Issue 1,

117

118 The Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods (FlowCAP) The goal of FlowCAP is to advance the development of computational methods for the identification of cell populations of interest in flow cytometry data. FlowCAP will provide the means to objectively test these methods, first by comparison to manual analysis by experts using common datasets, and second by prediction of a clinical/biological outcome.

119 Způsoby pomocí kterých lze upravit výsledky: 1. Odstranění „doublets“ 2. Čas jako parametr pro kontrolu kvality Příklad - pro DNA analýzu je třeba: - odstranit „debris“ a shluky - odstranit „doublets“ - udržovat konstantní průtok K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

120 DNA Histogram G 0 -G 1 S G 2 -M Fluorescence Intensity # of Events

121 Co je problém při vícebarevné detekci? K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

122 Emission Spectra–Spectral Overlap

123 Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci Proces při kterém dochází k eliminaci všech fluorescenčních signálů kromě signálu z fluorochromu který má být na příslušném detektoru detekován Nastavení pomocí mixu mikročástic či buněk označených/neoznačených příslušnými fluorochromy. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

124 Co je problém při vícebarevné detekci? K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

125 Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

126 126 “Bright” = good resolution sensitivity

127 127 Various fluorochromes-stain index

128 128 Choices for 6,- 8,- 10,- and more colors

129 129 Fluorochrome selection considerations

130 130 FITC Spillover 650nm700nm PerCP-Cy /40 500nm600nm FITC 530/30 Relative Intensity Wavelength (nm) 550nm PE 585/42 750nm800nm

131 131 FITC Compensation 650nm700nm PerCP-Cy /40 500nm600nm FITC 530/30 Relative Intensity Wavelength (nm) 550nm PE 585/42

132 132 FITC Compensation 650nm700nm PerCP-Cy /40 500nm600nm FITC 530/30 Relative Intensity Wavelength (nm) 550nm PE 585/42

133 133 FITC Compensation Dot plot showing uncompensated FITC data Dot plot showing compensated FITC data Biexponential dot plot showing compensated FITC data

134 134 FITC Spillover 600nm500nm550nm FITC 530/30 Relative Intensity Wavelength (nm) PE 585/42

135

136

137

138 Kompenzace fluorescenčního signálu K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie FITC positive & negative PE negative beads #2

139 Kompenzace fluorescenčního signálu K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie FITC positive & negative PE negative beads NONE!

140 Kompenzace fluorescenčního signálu

141 Nastavení kompenzací parametr - detektor amp. FL FL kompenzace FL %FL2 FL %FL1  značené mikročástice – pro běžně konjugované fluorochromy  značené buňky – pro vitální značení

142 142 Effects of Changing PMT Values FITC Voltage Increased by 5 V FITC Voltage Decreased by 5 V Correct Compensation

143 Which marker for compensation? Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). Use bright markers to setup proper compensation.

144 144 BD Comp Beads Always positive Bright staining Save sample (HIV patients) Use the same antibody for compensation and the real experiment

145 145 BD Comp Beads

146 146 PBMC were stained as shown in a 3-color experiment. Compensation was properly set for all spillovers Courtesy Mario Roederer Fluorescence Minus One

147 Tandemové značky

148 Tandemové značky - příklad

149 149 Tandems are light sensitive 0 hours 2 hours 22.5 hours PE (FL2 ) CD8 CD3 PE- Cy5 PE-Cy7 Time Sample Left in Light

150 Kompenzace - literatura Mario Roederer - Compensation in Flow Cytometry Current Protocols in Cytometry (2002) John Wiley & Sons, Inc. M. Loken, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1977). Two-color immunofluorescence using a fluorescence-activated cell sorter. J. Histochem. Cytochem. 25: M. Roederer & R. F. Murphy (1986). Cell-by-cell autofluorescence correction for low signal-to-noise systems: application to EGF endocytosis by 3T3 fibroblasts. Cytometry 7: S. Alberti, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1987). A single laser method for subtraction of cell autofluorescence in flow cytometry. Cytometry 8: C. B. Bagwell & E. G. Adams (1993). Fluorescence spectral overlap compensation for any number of flow cytometry parameters. in: Annals of the New York Academy of Sciences, 677: K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

151 No Data Analysis Technique Can Make Good Data Out of Bad Data! Shapiro’s 7th Law of Flow Cytometry

152 Shrnutí přednášky sorting zpracování signálu vizualizace dat a „gating“ kompenzace Na konci dnešní přednášky byste měli: 1.Znát základní principu sortování, 2.popsat způsob zpracování signálu, 3.rozumět lin / log zesílení signálu, 4.rozeznat jednotlivé způsoby vizualizace dat, 5.chápat základní principy „gatingu“, 6.znát princip kompenzace signálu při vícebarevné detekci. Na konci dnešní přednášky byste měli: 1.Znát základní principu sortování, 2.popsat způsob zpracování signálu, 3.rozumět lin / log zesílení signálu, 4.rozeznat jednotlivé způsoby vizualizace dat, 5.chápat základní principy „gatingu“, 6.znát princip kompenzace signálu při vícebarevné detekci. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie


Stáhnout ppt "Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 3 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno tel.:"

Podobné prezentace


Reklamy Google