Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

CYCLIN DEPENDENT KINASES AND CELL CYCLE CONTROL Nobel Lecture, December 9, 2001 Paul M. Nurse.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "CYCLIN DEPENDENT KINASES AND CELL CYCLE CONTROL Nobel Lecture, December 9, 2001 Paul M. Nurse."— Transkript prezentace:

1 CYCLIN DEPENDENT KINASES AND CELL CYCLE CONTROL Nobel Lecture, December 9, 2001 Paul M. Nurse

2 Modelový organismus  Schizosaccharomyces pombe  μm x 3-4 μm,  méně než 5000 genů  má eukaryotický buněčný cyklus (fáze G1, S, G2 a M)  má dělící vřeténko

3 Izolace mutantů  teplotně-senzitivní mutanti  Nejčastěji defektivní v mitóze a v dělení buňky  Wee mutanti: malá velikost –proces BC je spojen s růstem buňky  Fenotyp mutanta – 1 gen wee1  Pokus s restriktivní T – wee1 v G2 (načasování mitózy)

4 Izolace mutantů – obr.1 Graf: Restriktivní teplota v čase 0, plné trojúhelníky=% dělících se wee mut., plné kruhy= velikost buňek

5 Wee1 mutant  Nástup S-fáze a M-fáze je koordinován s dosažením kritické velikosti  Produkt genu wee1=inhibitor nástupu mitózy  Fenotyp wee mutanta= ztráta wee1 genu

6 Wee2 mutant  Objeven dominantní mutant wee2  Wee2= cdc2 (je nezbytný pro nástup mitózy)  Cdc2 může být mutován dvěma způsoby:  1) ztráta fce blokující mitózu  2) získání fce urychlující mitózu -malá velikost buňek

7 Wee1 a cdc2 (wee2)  Wee1= inhibitor nástupu mitózy  Cdc2= aktivátor nástupu mitózy  Společná úloha v regulaci nástupu mitózy  Cdc2 také v nástupu S-fáze  Cdc2 vyžadován 2x během BC… ? Biochem. procesy S-fáze a mitózy jsou velmi odlišné ?

8 Molekulární charakteristika Cdc2p  cdc2 ts transformováni na základě homologní rekombinace (použití ARS a selektivních markerů) (menší výtěžky než u S.cerevisiae) o transformováno knihovnou z S.c.-hledání komplementárního genu na základě hybridizace o Nalezen 1 gen který je schopen „vyléčit“ cdc2 ts - CDC28 o CDC28 a cdc2 jsou funkčně ekvivalentní

9 Molekulární charakteristika Cdc2p  Cdc2p + antibodies = imunoprecipitace  kinázová aktivita a je termosensitivní v extraktu z cdc2 ts in vitro  Potvrzeno: CDC28 je taky kináza  Kinázová aktivita v průběhu BC kolísá, ale s jediným vrcholem v nástupu mitózy (G2/M)

10 Molekulární charakteristika Cdc2p - obr.2 Synchroní kultury wt Prázdné body= %dělících se buňek Plné body= Cdc2p aktivita

11 Molekulární charakteristika Cdc2p  Naklonovány geny wee1 a cdc25= upstreamově ovlivňují aktivitu Cdc2p  Wee1p = fosforylační aktivita  Cdc25p = antagonista Wee1p mitotického inhibitoru

12 Molekulární charakteristika Cdc2p -obr.3

13 Biochemická analýza fosforylace Cdc2p  Cdc25p fosforyluje na pozici tyrosinu 15  Fosforylace je asociována s G2-fází když je aktivita Cdc2p nízká  Tyrosin 15 je v blízkosti ATP binding site = ovlivňuje katalitickou aktivitu

14 Biochemická analýza fosforylace Cdc2p  Potvrzeno= nefosforylovaný phenylalanine 15 mutant vchází předčasně do mitózy  Cdc25p je vyžadován k odstranění Pi z tyrosinu 15 z Cdc2p  Aktivita Cdc2p je regulována fosforylací = úroveň fosforylace je regulována Wee1p (mitotic inhibitor) a Cdc25p (mitotic activator)

15 Další regulace Cdc2p  Gen cdc13 = podobný cyklinu z ježovky, což je regulátor časného embryonálního rýhování  Cdc13p cyklin je nutný pro aktivaci Cdc2p k přechodu z G2 do M

16 Univerzální role Cdc2p v CCC  Snaha o nalezení cdc2 homologu na základě strukturální podobnosti  Problém: v lidském těle cca 500 kináz  cDNA knihovna z člověka do cdc2 ts mutantů  Nalezen lidský homolog cdc2 který je schopen plně nahradit cdc2 ts  63%homologie ( M.years)  BC a jeho cdc2 je hluboce konzervován

17 Univerzální role Cdc2p v CCC

18  MPF (maturation promoting factor) izolovaná z žabího vajíčka = 2 proteiny  32kD = homolog Cdc2p (Western blot a imunoprecipitace)  MPF je stejný v žábě, hvězdici i kvasince  Univerzální pro všechny eukaryota

19 Další důležité role CDKs  Buňka musí projít každou fází BC jen jednou  Řízeno G2/M CDK (Cdc2p/Cdc13p)  V G2 blokují možný nástup S-fáze  Overexprese spec. inhibitoru G2/M CDK (Ram1p) zároveň navodí více S-fází = buňky s vyšší ploidií  Delece Cdc13p G2/M cyklinu má stejný účinek

20 Další důležité role CDKs

21 To je vše  Děkuji za pozornost


Stáhnout ppt "CYCLIN DEPENDENT KINASES AND CELL CYCLE CONTROL Nobel Lecture, December 9, 2001 Paul M. Nurse."

Podobné prezentace


Reklamy Google