Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Isoenzymová analýza Využití v systematické biologii.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Isoenzymová analýza Využití v systematické biologii."— Transkript prezentace:

1 Isoenzymová analýza Využití v systematické biologii

2 Základní termíny  Isozymy -enzymy kódované v různých lokusech, vykazující stejnou nebo podobnou aktivitu. )  Alozymy -alelické formy téhož enzymu (kódované v jednom lokusu)  Zymodem -taxonomická jednotka vymezená na podkladě isozymového vzoru  Zymogram - rozložení zón a tedy i jednotlivých enzymů na elektroforetogramu

3 Princip metody Detekce elektroforetickou mobilitou se lišících forem enzymů kódovaných různými alelami určitého genu. Jednotlivé enzymy se detekují prostřednictvím jejich specifické aktivity, většinou pomocí spřažené enzymatické reakce s barevným produktem.

4 4 Příklad zymogramů Alozymová analýza Toxoplasma gondii

5 Věcný (biologický) podklad metody  Velké množství genů pro enzymy je polymorfních (nejhojnější alela <90 %)  Velká část tohoto polymorfismu představuje polymorfismus vnitropopulační (obvykle 15 % genů je polymorfních, od 0-50 %) (málo ptáci!)  Alozymy se liší sekvencí aminokyselin, značná část změn se projeví změnami elektromobility.

6 Postup  plánování pokusu (pilotní pokus)  sběr a konzervace materiálu  homogenizace  elektroforéza  detekce  odečet zón na elektroforetogramu  statistické vyhodnocení a biologická interpretace

7 Elektroforéza homogenizace Sběr materiálu centrifugace elekroforéza barveníOdečet zón

8 Elektroforéza

9 Detekce Princip: Tetrazoliové soli jsou redukovány na modrý formazan Chromogenní substrát: methyl thiazolová modř(MTT) přenašeč elektronů: phenasin methosulfát (PMS) Glukozofosfát isomeráza fruktozo-6-fosfátglukozo-6-fosfát glukonolakton-6-fosfát NADPNADPH fruktozo-6-fosfát, NADP, MgCl 2,MTT, PMS, glukozo-6-fosfát dehydrogenáza GPIGPD NADP MTTformazan PMS

10 Sledované rozdíly  Fixované alely  Rozdíly ve frekvenci jednotlivých alel

11 Hlavní výhody  Kodominance  Množství polymorfismu je vhodné pro vnitropopulační studie  Znaková metoda  Cena analýzy a cena vybavení

12 Limity metody  Konvergence (i různé alozymy mohou mít shodnou elektromobilitu)  když rozliším 5 poloh a dva druhy se liší ve 30 % pruhů, budou 2/3 shodných pruhů ve skutečnosti reprezentovat jiné alozymy  Maximální divergence %  u žab na úrovni rodu či spíše druhů  u savců na úrovni podčeledí

13 Hlavní oblasti využití  Studium populační struktury  rozmnožovací struktura (např. panmixie)  vazebná nerovnováha  migrace  genetická příbuznost populací  Studium druhové diversity  kryptické (sibling) druhy (sym/alopatrické)  determinace známých druhů  Fylogeneze

14 Struktura populací  V panmiktické populaci Hardy- Weinbergova rovnováha AA Aa aa np 2 2np(1-p) n(1-p) 2

15 Možné příčiny odchylek od H-W rovnováhy  Wahlundův efekt  kryptické druhy  parthenogeneze  strukturovanost populace  asortativní rozmnožování  Selekce

16 Způsob testování odchylek od H-W rovnováhy  CHI 2 test (slabý test, nevhodný pro kombinovaná data z více lokusů) Σ(F pozorovaná -F očekávaná ) 2 /F očekávaná  Smithova H statistika (mnohem lepší) H=[(4n 2 p(1-p) - (2n-1)N het )]/4n(n-1) konfidenční intervaly: H ± Z 0,05 (p 2 (1-p) 2 )/(n-0,5) Z 0,05 =1,96 (N>60), Z 0,05 =2 (N=60) Z 0,05 =2,04 (N=30)

17 Příklad testování odchylek od H-W rovnováhy A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 n Pozorováno Frekvence alely A 1 (p) p = [(2 × 40) + 35]/ (2 × 100) = 0,575 Frekvence alely A 2 (q) q = 1 – p = 0,425 A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 n Očekáváno 100 × p × pq 100 × q ,0 48,9 18,1100 χ 2 = (40 – 33,0) 2 + (35 – 48,9) 2 + (25 – 18,1) 2 = 8,1 33,0 48,9 18,1 Df: 3 – 1= 2, P < 0,01

18 Příklad testování odchylek od H-W rovnováhy II Frekvence alely A 1 (p) p = [(2 × 40) + 35]/ (2 × 100) = 0,575 Frekvence alely A 2 (q) q = 1 – p = 0,425 H=[(4n 2 p(1-p) - (2n-1)N het )]/4n(n-1) = = [4 × × 0,575 × 0,425 – (2 × 100 – 1) × 35] = 0,071 C.I. 95 = H ± Z 0,05 (p 2 (1-p) 2 )/(n-0,5) C.I. 95 = H ± 1,96(0,57 × 0,43)/( ,5) C.I. 95 = 0,071 ± 0,0012 Nezahrnuje 0, je kladná: signifikantní nadbytek homozygotů) A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 n Pozorováno

19 Testování vazebné nerovnováhy Chi 2

20 Testování rozdílů ve frekvenci alel Používá se Chi 2 test Pozor: I na velkém souboru jedinců nejde mnohdy prokázat menší rozdíl ve frekvenci. Minimální velikost souboru je asi 50 jedinců, většinou potřeba stovek až tisíců jedinců. Nutný pilotní pokus.

21 Určování genetické vzdálenosti populací Rogersova vzdálenost R= (0,5 Σ (x i - y i ) 2 ) 0,5 (1 lokus) Pro víc lokusů -aritm. průměr (x i, y i –frekvence i-té alely v jedné a druhé populaci) Neiovská vzdálenost D= -ln I, I= Σ x i y i /( Σ x i 2 Σ y i 2 ) 0,5 ) Pro víc lokusů: I=Jxy /(JxJy) 0,5 ( Jxy, Jx a Jy jsou postupně aritm. průměry z Σ x i y i, Σ x i 2 a Σ y i 2 pro všechny lokusy) Mortonův příbuzenský koeficient K AB = ((x i -P i )(y i -P i ))/P i (1-P i ) ( P i : frekvence i-té alely v metapopulaci)

22 Problém s haploidními organismy Neexistují heterozygoti, nutno nahradit analýzou frekvence haplotypů Ab u jednoho typu, aB u druhého Nevýhoda: H-W rovnováha se ustavuje v jedné generaci, vazebná nerovnováha přetrvává mnoho generací poté, co již její příčina pominula.

23  Kryptické druhy (liší se většinou 10 % fixovaných alel) když je frekvence alel mezi % stačí poměrně malé N, např. 5 a 5 exemplářů, abychom prokázali podezřelou absenci heterozygotů Příklad: druh A: 3 kusy, druh B: 7 kusů, N het (teor) = = 2pq = 0,42; P=(1- 0,42) 10 =0,58 10 = 0,004  pozor na příbuzné Studium druhové diversity  dobré najít další znaky

24 Determinace organismů  Pozor při využívání mimo původní areál  Preference nedestruktivních metod  Cena

25 Studium fylogeneze Vhodné: především fixovaný polymorfismus, méně vhodné: frekvence alel. Lze využít jak znakové tak distanční metody.

26 Závěry  Alozymová analýza je technicky nenáročná metoda vhodná ke zpracovávání velkého počtu jedinců.  Jedná se v principu o jednolokusovou metodu, lze jí však postupně studovat desítky lokusů.  Není jisté, zda monitoruje selekčně neutrální znaky.  Je spíše vhodná pro relativně příbuzné OTU.


Stáhnout ppt "Isoenzymová analýza Využití v systematické biologii."

Podobné prezentace


Reklamy Google