Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Transkripce u prokaryot a eukaryot (kapitola 11) 3. (regulace transkripce – zvláštní přednáška později) Molekulární biologie.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Transkripce u prokaryot a eukaryot (kapitola 11) 3. (regulace transkripce – zvláštní přednáška později) Molekulární biologie."— Transkript prezentace:

1 Transkripce u prokaryot a eukaryot (kapitola 11) 3. (regulace transkripce – zvláštní přednáška později) Molekulární biologie

2 Transkripce – proces, při kterém je informace z DNA převedena do RNA. DNA pouze uchovává informaci, ale kromě toho sama není zdrojem funkcí nutných pro život buňky. Slouží jako tempát pro výrobu RNA (mRNA i nekódující RNA) a proteinů. RNA messenger RNA (mRNA) - kóduje informaci pro výrobu proteinů nekódující RNA – plní funkci sama o sobě, nekóduje proteiny (tRNA,rRNA,snRNA…)

3 antisense vlákno (templátové, nekódující) sense vlákno (netemplátové, kódující) vlákna jsou od sebe dočasně oddělena (denaturují) vyrobeno nové vlákno RNA RNA vlákno je komplementární k antisense vláknu DNA RNA stejná jako sense vlákno DNA, ale z ribonukleotidů a místo T jsou U syntéza vždy ve směru 5’ - 3’ (3’OH ribozy s 5’fosfátem sousedního nukletodu) pouze jedno vlákno se přepisuje (transkribuje) do RNA Pouze malý počet genů je v daný moment transkribováno, většina podléhá přísně časové a tkánově specifické regulaci podle aktuálních potřeb buňky. Houskeeping geny (konstitutivní) – geny nutné pro základní buněčné procesy, exprimovány téměř pořád

4 Pouze jedno vlákno je transkribováno pro daný gen, ale někdy může být druhé vlákno užito jako templát pro jiný gen ležící v opačné orientaci a překrývající se s prvním!

5 cistron – část DNA nebo RNA kódující jeden protein či jednu nekódující RNA MONOCISTRONNÍ RNA POLYCISTRONNÍ RNA EUKARYOTA PROKARYOTA transkripce translace OPERON operon – u prokaryot, několik genů v těsné blízkosti přepisující se do jedné společné mRNA, která pak ale kóduje více proteinů a je tedy polycistronní. Většinou geny s podobnou funkcí (pro stejnou metabolickou dráhu).

6 Figure 6-21 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Na eukaryotní RNA probíhá po transkripci mnoho úprav, než je ji možno přepsat do proteinu! RNA úpravy export z jádra

7 promotor – část DNA před genem, na kterou se váže RNA polymeráza a další proteiny umožňující začátek transkripce 5’UTR (5’untranslated region) – oblast mRNA na jejím 5’konci, která není translatována 3’UTR (3’untranslated region) – oblast mRNA na jejím 3’konci, která není translatována, za stop kodonem ORF ORF (open reading frame) – otevřený čtecí rámec, souvislý sled bazí DNA(RNA) kódujcí protein Ne celá mRNA kóduje protein! Struktura genu

8 TRANSKRIPCE U PROKARYOT Proces samotné syntézy RNA je vpodstatě totožný u prokaryot a eukaryot, ale liší se regulační mechanismy.

9 Jak RNA polymeráza rozpozná správné místo na DNA, kde začít transkripci? dvojvláknová DNA komplex RNA polymerázy jednovláknová mRNA

10 Figure 6-11 (part 1 of 7) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Molekulární interakce se ‘sigma (  ) faktorem’ umožní RNA polymeráze vázat DNA na specifických úsecích DNA nazývaných promotory Samotné ‘core’ RNA polymerázového komplexu je schopné syntézy RNA, ale není schopné rozpoznat a vázat DNA RNA polymeráza

11 Rozpoznání promotoru -10 a -35 sekvence (vzhledem k počátku transkripce) sekvence rozeznávané sigma podjednotkou, umožňují vazbu core, rozpletení DNA a počátek transkripce. Sigma faktor se na DNA nemůže vázat sám, ale vždy v komplexu se zbytkem polymerázy holoenzym RNA polymerázy = core ze 4 podjednotek + sigma podjednotka (= 5 celkem)

12 Síla promotoru je dána podobností -10 a -35 sekvence ke konsensu (čím podobnější, tím častější nasedání polymerázy a tím silnější promotor) E.coli Promotorové sekvence se liší mezi jednotlivými geny i mezi jednotlivými druhy prokaryot. úsek bohatý na TA, snadněji se rozvolní (taje) -10 a -35 sekvence ‘konsensus‘ sekvence

13 antisense vlákno sense vlákno RNA polymeráza RNA polymeráza trankripční bublina rostoucí řetězec mRNA směr syntézy Po navázání sigma faktoru se vytvoří transkripční bublina na -10 oblasti (TA rich), díky tomu otevření DNA a umožnění syntézy prvních 8-9 párů bazí mRNA. Bublina pokračuje spolu s polymerázou po celé délce genu. První transkribovaná báze je většinou A obklopená dvěma pyrimidiny (CAT sekvence), někdy G. Není potřeba primer jako u DNA replikace. žlábek uvnitř polymerázy pojme 16bp DNA (u eukaryot 25) Průběh transkripce

14 elongační fáze: sigma faktor odpadne, core polymerázy se uvolní z promotoru a syntetizuje zbytek mRNA rychlostí 40 nukleotidů za sekundu (replikace 1000 bp/s, translace 15 AA/s) iniciační fáze: RNA polymeráza se naváže a zůstává sedět na promotoru až do syntézy prvních 8-9 bazí RNA gyráza přidává negativní superotáčky před polymerázou, topoizomeráza I odebírá negativní superotáčky za polymerázou kontrola správnosti inkorporovaných bazí je malá. terminační fáze: ukončení transkripce odpojením RNA od polymerázy na specifických místech okamžité pokrytí mRNA ribozomy, mRNA před translací nepodléhá dalším úpravám

15 Jak RNA polymeráza rozpozná správné místo, kde skončit transkripci? dvojvláknová DNA komplex RNA polymerázy jednovláknová mRNA

16 TERMINACE TRANSKRIPCE mRNA na svém 3’konci vytvoří vlásenku, což způsobí zastavení polymerázy (asi 60 sekund) slabé vazby mezi úsekem UUU v mRNA a AAA v DNA způsobí samovolné odpojení mRNA terminátor - invertovaná repetice, za ní několik A, tvorba vlásenky odpadne i polymeráza

17

18 Terminace – Rho independentní (intrinsic termination) – Rho dependentní Rho faktor ATP dependentní helikáza, odděluje řetězce DNA hexamer 6 stejných podjednotek cestuje od začátku spolu s polymerázou na mRNA se váže nukleotidů před terminátorem poté, co RNA polymeráza nasyntetizuje jeho vazebné místo (G-rich, C-poor)

19 Transkripční cyklus u prokaryot - video

20 Jak buňka ví, které geny zapnout? Kontitutivní geny – zajišťují základní buněčné funkce, nutné pořád. Mají -10 a -35 sekvence blízké konsensu, sigma faktor a polymeráza nasedají samovolně, i když s různou frekvencí podle síly promotoru. Geny nutné pouze za určitých podmínek (inducibilní) 1.Rozpoznávány specifickými sigma faktory Například sigma 32 se váže pouze na geny tepelného šoku (nejsou rozpoznávány normálním sigma faktorem, jiná rozpoznávací sekvence ), umožňuje bakterii přežití vysokých teplot. Za normálních podmínek je sigma 32 inaktivován vazbou na jiný protein, po odeznění tepelného šoku se opět inaktivuje. 2.Sekvence -10 a -35 je tak málo podobná konsensu, že sigma podjednotka úsek sama nerozezná a je potřeba aktivační protein (různé pro různé skupiny genů)

21 Aktivační protein (aktivátor) – váže se na sekvenci v promotoru a usnadňuje nasednutí sigma faktoru, obdoba transkripčních faktorů u eukaryot. Proč se aktivační proteiny na DNA nevážou pořád?

22 Aktivační proteiny a represory mění svou konformaci po vazbě signálních molekul forma neschopná vazby DNA forma schopná vazby DNA signální molekula (například některá z živin nutných pro růst buňky) vazebné místo pro signální molekulu DNA vazebné místo alosterická změna DNA vazebné místo

23 Regulační proteiny často vážou invertované repetice na DNA Díky 3D struktuře DNA jsou vazebná místa na stejné straně helixu. ‘head-to-head’ orientace

24 Maltóza působí jako induktor MalT protein aktivuje expresi genů zpracovávajících maltózu pokud není maltóza v buňce přítomna, MalT se není schopen vázat na DNA a transkripce genů se nekoná maltóza působí jako induktor, váže se na MalT a způsobí jeho konformační změnu. Odkryje se DNA vazebná doména, MalT se může vázat na DNA a spustí transkripci genů zpracovávající maltózu podobné mechanismy u ostatních živin

25 Represory negativně regulují transkripci Lac I protein blokuje expresi genů zpracovávajících laktózu váže se na operátor, sekvenci překrývající se s promotorem, čímž brání vazbě RNA polymerázy laktóza způsobí alosterickou konformační změnu Lac I vedoucí k odpojení od DNA, transkripce může začít promotor operátor induktor promotor induktor

26 Kaczanowska M, and Rydén-Aulin M Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2007;71: Transkripce rRNA a tRNA rrnB operon 90% veškeré RNA v bakteriální buňce představuje rRNA: 16S, 23S a 5S rRNA jsou syntetizovány na stejném primárním transkriptu, v intronech navíc některé tRNA (ostatní tRNA samostatně nebo spolu s jinými geny). Vyštěpení RNAsami. jediný ‘sestřih’ probíhá u rRNA a tRNA, ne u mRNA

27 TRANSKRIPCE U EUKARYOT

28 Eukaryota mají 10x více genů než prokaryota, navíc je DNA uzavřená v jádře mnohem složitější regulace exprese transkripce probíhá v jádře, ne v cytoplazmě 3 RNA polymerázy, k tomu zvláštní RNA polymeráza v mitochondriích a chloroplastech RNA polymeráza Iribozomální RNA (5.8S, 18S, 28S), ½ až ¾ celkové RNA v buňce! RNA polymeráza III geny pro tRNA, 5S ribozomální RNA, některé snRNA a small RNA většinou konstitutivní exprese, ribozomy a tRNA nutná stále RNA polymeráza II geny kódující proteiny, snoRNA, miRNA, siRNA, snRNA potřebuje obecné (TFI, TFII, TFIII) a specifické transkripční faktory iniciační komplex se sestavuje až na promotoru (prokaryota maji sigma faktor asociovaný už před vazbou na DNA)

29 Transkripce rRNA pomocí PolI probíhá v genových klastrech Klastry (shluky) mnoha tandemových repetic rRNA genů na pěti rozdílných chromozomech RNA polymeráza I transkribuje 45S RNA, která je dále štěpena na 18S, 5.8 a 28S 5.8 S 5S je transkribována PolIII a musí být dopravena do jadérka Ribozomání proteiny trankribovány PolII a také musejí být dopraveny do jadérka netranskribované oblasti

30 Většina rRNA se transkribuje a upravuje v jadérku fibrilární centrum obsahující RNA PolI a nově transkribované rRNA granulární oblast obsahující rRNA+ribozomální proteiny ‘vánoční stromeček’

31 UBF1 – upstream binding factor I Váže se na ‘core promotor’ a ‘upstream control element’, obojí GC bohaté a téměř totožné SL1 komplex obsahuje 4 proteiny včetně TBP (TATA binding protein) Rozvolní DNA, umožní navázání RNA Pol I za pomoci TIF1A a dalších transkripčních faktorů RNA polymeráza I

32 RNA polymeráza III promotor uvnitř genu TFIIIC nebo TFIIIA se váže 50bp downstream, rozvolní chromatin umožní vazbu TFIIIB komplexu obsahující TBP a následně PolIII SL1 a TFIIIB – podobná úloha jako sigma faktory u prokaryot, správné umístění polymerázy.

33 RNA polymeráza II karboxy terminální doména asi 50 repetic 7 aminokyselin (Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser) fosforylace na Ser a Thr umožňuje elongaci polymerázy clamp doména Otevřená umožňuje vazbu DNA, pak se uzavře a obejme DNA, umožňuje její procesivitu (elongaci bez odpadnutí Pol) podjednotek

34 Regulační oblasti protein kódujících genů obecné (bazální) transkripční faktory (TFIID,A,B,F,E,H,J) některé specifické TF specifické transkripční faktory (tkáňově nebo vývojově) ENHANCER (nebo silencer) PROMOTOR Sekvence upstream nebo downstream od promotoru vážou specifické TF. Kombinace vazebných míst pro různé TF je zodpovědná za obrovskou rozmanitost exprese jednotlivých genů, rozdílnou expresi genů v závislosti na typu tkáně, signálům z vnějšku atd.

35 Iniciátor – sekvence DNA těsně před počátkem transkripce – první transkribovaná báze A jako u prokaryot TATA box - 25bp upstream, rozpoznáván TBP proteinem (TATA binding protein), TA bohata oblast uprostřed GC bohate oblasti Upstream elementy polymeráza může začít transkripci pouze za přítomnosti TATA boxu a iniciátoru, ale to je málo účinný proces upstream elementy zvyšují účinnost transkripce po vazbě transkripčních faktorů GC box – GGGCGG, váže SP1 transkripční faktor CAAT box – GGCCAATCT, váže CTF/NF1 oktamer element – ATTTGCAT, váže Oct1 PROMOTOR

36 TFIID obsahující TBP se váže na TATA box TFIIA, TFIIB polymeráza + TFIIH Polymeráza schopná syntézy, ale nemůže se odpoutat do promotoru – ‘připravená polymeráza’ (poised polymerase). Mnoho genů je takto zastaveno po velmi dlouhou dobu, připraveny k rychlému použití. PRŮBĚH TRANSKRIPCE RNA POLYMERÁZOU II Iniciace Stejně jako u PolI a PolIIi je vždy promotor rozeznáván napřed DNA vázajícím proteinem, který teprve umožní vazbu samotné polymerázy.

37 Uvolnění polymerázy a elongace TFIIF, TFIIE, TFIIJ TFIIH (CDK7) fosforyluje Ser5 v CTD doméně PolII Polymeráza se odpoutá a pokračuje elongací, všechny TFII odpadnou kromě TFIIH

38 NELF (negative elongation factor) DSIF (DRB-sensitivity inducing factor) Vážou se na PolII a zastaví transkripci po krátkém úseku elongace – ‘pauzující polymeráza’ (paused polymerase), pokud nejsou fosforylovány spolu s CTD (Ser2), a to pomocí některých specifických transkripčních faktorů rekrutujících P-TEFB (positive transcription elongation factor B) K efektivní elongaci je tedy nutné fosforylovat CTD, NELF a DSIF. Několikeré jištění, aby transkripce běžela pouze tehdy, když je to potřeba. PTEF-B Fosforylovaná CTD na sebe váže další faktory modifikující chromatin a usnadňující elongaci

39 RNA polymeráza má podjednotek, z toho 3 společné s PolI a PolIII. TFII faktory často obsahují také několik podjednotek, celý iniciační komplex obsahuje mnoho různých proteinů.

40 Specifické transkripční faktory váží upstream control elementy promotoru a zároveň TFIID nebo TFIIB a TFIIA (nikdy ne přímo polymerázu). Tím napomáhají sestavení iniciačního komplexu zvyšují frekvenci transkripce.

41 ENHANCERY (a SILENCERY) ohyb DNA a vytvoření smyčky (looping) sekvence upstream nebo downstream od promotoru (tedy i uvnitř genů), často velmi daleko obsahují shluky vazebných míst pro různé specifické transkripční faktory (aktivátory nebo represory) fungují v jakékoliv orientaci (‘5-3’nebo 3’-5’) zesilují nebo zeslabují transkripci díky kontaktu s transkripčním aparátem (často přes tzv. mediátorový komplex) specifické transkripční faktory s sebou přinášejí proteiny pozitivně nebo negativně modifikující strukturu chromatinu a průběh transkripce (koaktivátory a korepresory)

42 mediátor proteiny remodelující chromatin proteiny modifikující histony

43 Iniciace transkripce u eukaryot - video

44 Terminace transkripce u Eukaryot PolII PolII přepíše vysoce konzervovanou AAUAAA sekvenci na 3’ konci genu Na AAUAAA sekvenci se váže proteinový komplex obsahující endonukleázu a také polyadenylázu RNA je štěpena nukleotidů za AAUAAA, polyadenyláza syntetizuje poly-A ocas. RNA polymeráza odpadne.

45 Terminace transkripce u Eukaryot PolI PolIII - podobný prokaryotické terminaci, v RNA je GC bohatá část a za ní 4xU, někdy bez vlásenky. K terminaci dochází tedy samovolně, není potřeba dalších proteinů. PolI - několik A na 3’konci genu, za nimi Sal box sekvence rozpoznávaná terminačním faktorem. Uvolnění RNA po jejím štěpení. prokaryota PolII PolIII

46 Transkripční továrny (transcription factories) Current Opinion in Genetics & Development 2010, 20:127–133

47 Metody studia promotorů a DNA-proteinových interakcí (str , kapitola 17)

48 Deleční analýza promotorů Kde jsou v promotoru lokalizované regulační elementy? Klonování promotorových úseků před reportérový gen a měření transkripce podle síly exprese reportérového genu. gen pro luciferázu, b-galaktosidázu atd., jehož produkt lze snadno kvantifikovat studovaný gen reportérový gen hybridní gen neboli genová fůze

49 Deleční analýza promotorů enhancer silencer enhancer Vážou dané úseky DNA proteny? DNAse footprint, gel shift assay, ChIP…

50 Elektroforéza nukleových kyselin Separace DNA nebo RNA molekul v agarózovém gelu na základě jejich rozdílné velikosti. horizontální elektroforéza Koncentrace agarózy agarózový gel

51 polyamidakrylový gel vertikální elektroforéza

52 Vinckevicius A, and Chakravarti D J Mol Endocrinol 2012;49:R113-R123 koncetrace proteinového extraktu In vitro testy: DNAseI footprint Váže daný úsek DNA protein(y)? Inkubace značené DNA próby s nukleárním extraktem a její štěpení DNAsouI. Úseky DNA pokryté proteinem nebudou přístupné štěpení.

53 Vinckevicius A, and Chakravarti D J Mol Endocrinol 2012;49:R113-R123 Váže se daný protein na určitý úsek DNA? Stanovení migrace gelem. Volná DNA gelem migruje rychleji než DNA s navázaným proteinem. In vitro testy: Gel shift assay (Gel retardation assay) a

54 DNA afinitní chromatografie Který protein se váže na danou DNA sekvenci? buněčný lyzát kolonka s navázanou DNA různých sekvencích odmytí proteinů, které nevážou DNA eluce proteinů vázajících DNA DNA vazebné proteiny z kroku 1 kolonka s DNA pouze se sekvencí odmytí proteinů, které nevážou eluce proteinů vázajících DNA Izolace všech DNA vazebných proteinů Izolace proteinů vážících specifickou DNA sekvenci

55 Selekce oligonuklotidů Jakou sekvenci váže daný protein?

56 In vivo testy: Chromatinová precipitace Váže se daný protein na DNA přímo v jádře dané buňky? Kroslinkování všech proteinů v jádře k jejich DNA vazebným místům, lýze buňky, fragmentace DNA. Immunoprecipitace DNA- proteinových komplexů za pomoci specifické protilátky rozeznávající daný protein. Odmytí nenavázaných komplexů. Dekroslinkování a analýza izolované DNA.

57 Figure ChIA-PET Procedure Inside the nucleus, DNA protein interactions are 3D and involve DNA loops. After crosslinking, different regions of a chromosome are often associated with a single protein complex. After ChIP, each of these DNA sequences can be determined with paired end-tag sequencing. First, the immunoprecipitated DNA:protein complex is divided into two samples and each DNA end is connected to a different linker DNA. Then the two samples are recombined and mixed with very dilute ligase. The linkers anneal preferentially within the same complex, but occasionally there are interligations of paired tags. The ligated tags have a restriction enzyme site for MmeI, which recognizes its sequence in the tag, but cuts 20 nucleotides away in the DNA sequence. These small pieces of DNA are then sequenced using paired end-sequencing technology. In vivo testy: ChIA-pet (chromatin interaction analysis paired end-tag sequencing) Jaká je 3D struktura DNA- proteinováho komplexu v jádře dané buňky? 1. ChIP, izolace DNA-proteinových komplexů. 2. Ligovaní dvou typů linkerů na konce fragmentů a jejich spojení ligací. Koncentrace DNAsy taková, aby se preferenčně ligovaly úseky v ramci jednotlivého komplexu. Vyštěpení ligovaných konců a jejich sekvenování. Lze vidět, které části DNA se v dané chvíli nacházely blízko daného proteinu.

58

59 Conceptual questions


Stáhnout ppt "Transkripce u prokaryot a eukaryot (kapitola 11) 3. (regulace transkripce – zvláštní přednáška později) Molekulární biologie."

Podobné prezentace


Reklamy Google