Analýza a separace nukleových kyselin

Prezentace na téma: "Analýza a separace nukleových kyselin"— Transkript prezentace:

1 Analýza a separace nukleových kyselin

2 Literatura

3 PCR Mullis

4

5 PCR Mullis

6 Real time PCR

7 Real time PCR proteinů

8 Genetická daktyloskopie

9 Použití restrikčních enzymů - RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

10 Short tandem repeats

11 Short tandem repeats

12 Short tandem repeats

13 Testy paternity Zjednodušené testy
STR na Y chromosomu – mužských potomků srovnání s otcem Mitochondriální DNA – dědí se po matce – matroklinní dedičnost

14 Mitochondriální Eva

15 DNA chipy

16 DNA chipy

17 DNA chipy

18 DNA chipy

19 DNA chipy - barva skvrn

20 DNA chipy - vybavení

21 DNA chipy software

22

23 Proteinové chipy

24 Proteinové chipy – typy interakcí
Protilátka Antigen Ligand Detekce: SELDI MS, fluorescence, SPR, electrochemická, radioaktivity,

25 Anti-GST Probe Lecture 1.1

26 Blotting Southern – DNA Nothern – RNA Western - bílkoviny

27 Izolace nukleových kyselin

28 Cíl izolace Odstranění proteinů DNA vs RNA
izolace specifického typu NK

29 Typy NK genomická (chromosomalní)
organelová (mitochondrie, chloroplasty) plasmidy (extra-chromosomalní) virová (ds nebo ss) komplementární (mRNA)

30 Nejpoužívanější metody
na základě rozdílné rozpustnosti – extrakce, srážení na základě vlastností - chromatografie – polarita- adsorpční, náboj-ionexová sedimentace - gradientová ultracentrifugace

31 Postup 1. Rozbití buněk a membrán pro uvolnění NK
2. Inaktivace DNA- nebo RNA-degradujících enzymů (DNasy, RNasy). 3. Separace NK od dalších komponent uvolněných z buňky. Extrakce/Precipitace Chromatografie Ultracentrifugace

32 Extrakce/Precipitace

33 Organic extraction Brown p.28

34 Izolace genomické DNA Typická procedura 1.Sklizení buněk 2.Lyse buněk
0.5% SDS + proteinase K (55o několik hodin) 3.Fenolová extrakce Jemné třepání několik hodin 4.Ethanolová precipitace 5.Působení RNAsy a proteinasy K 6.Opakování kroku 3 a 4.

35 Extrakce/Precipitace
Krok 3: Organická extrakce Smíchání vzorku s organickou fází ve stejném poměru. Vodná fáze Centrifugace Použití vodné fáze e.g. phenol, chloroform, or phenol:chloroform Interfáze Organická fáze Opakovaná extrakce pro zvýšení čistoty Hrubý lyzát obsahující NK a další součásti buňky Vodná fáze obsahuje NK, organická fáze bílkoviny a lipidy. Nerozpustné složky přítomné v interfázi.

36 Extrakce/Precipitace
Krok 4: Precipitace NK Před Po Supernatant 70% EtOH Centrifugace Promytí Centrifugace Pelet Rozpuštění (H2O, TE, etc.) Přidání EtOH a soli 2-2,5 objem EtOH -20o C Vysoká I pH 5-5.5

37

38 Chromatografie

39 Adsorpční chromatografie

40 Adsorpční chromatografie

41 Ionexová chromatografie
Vazba při nízkém pH nízké I Eluce zvýšením pH nebo vysokou I

42 Gradientová centrifugace

43 Diferenciální versus gradientová centrifugace

44 Separation of Nucleic Acids by CeCl Gradient Centrifugation

45 Plasmid DNA Brown p.44

46 Izolace RNA - speciální přístupy
nutno použít inhibitory RNAsy extrakce guanidium chloridem fenolová extrakce při pH < 4 (pH 8 pro DNA) působení RNase-free Dnase selektivní precipitace rRNA, mRNA s LiCl oligo-dT afinitní chromatografie - mRNA

47 Kontrola čistoty a kvantifikace NK

48 Kontrola degradace: DNA
genomická DNA (degradovaná)

49 Kontrola degradace: RNA
25S 18S