Stáhnout prezentaci
Prezentace se nahrává, počkejte prosím
1
CYCLIN DEPENDENT KINASES AND CELL CYCLE CONTROL Nobel Lecture, December 9, 2001 Paul M. Nurse
2
Modelový organismus Schizosaccharomyces pombe 12-15 μm x 3-4 μm, méně než 5000 genů má eukaryotický buněčný cyklus (fáze G1, S, G2 a M) má dělící vřeténko
3
Izolace mutantů teplotně-senzitivní mutanti Nejčastěji defektivní v mitóze a v dělení buňky Wee mutanti: malá velikost –proces BC je spojen s růstem buňky Fenotyp mutanta – 1 gen wee1 Pokus s restriktivní T – wee1 v G2 (načasování mitózy)
4
Izolace mutantů – obr.1 Graf: Restriktivní teplota v čase 0, plné trojúhelníky=% dělících se wee mut., plné kruhy= velikost buňek
5
Wee1 mutant Nástup S-fáze a M-fáze je koordinován s dosažením kritické velikosti Produkt genu wee1=inhibitor nástupu mitózy Fenotyp wee mutanta= ztráta wee1 genu
6
Wee2 mutant Objeven dominantní mutant wee2 Wee2= cdc2 (je nezbytný pro nástup mitózy) Cdc2 může být mutován dvěma způsoby: 1) ztráta fce blokující mitózu 2) získání fce urychlující mitózu -malá velikost buňek
7
Wee1 a cdc2 (wee2) Wee1= inhibitor nástupu mitózy Cdc2= aktivátor nástupu mitózy Společná úloha v regulaci nástupu mitózy Cdc2 také v nástupu S-fáze Cdc2 vyžadován 2x během BC… ? Biochem. procesy S-fáze a mitózy jsou velmi odlišné ?
8
Molekulární charakteristika Cdc2p cdc2 ts transformováni na základě homologní rekombinace (použití ARS a selektivních markerů) (menší výtěžky než u S.cerevisiae) o transformováno knihovnou z S.c.-hledání komplementárního genu na základě hybridizace o Nalezen 1 gen který je schopen „vyléčit“ cdc2 ts - CDC28 o CDC28 a cdc2 jsou funkčně ekvivalentní
9
Molekulární charakteristika Cdc2p Cdc2p + antibodies = imunoprecipitace kinázová aktivita a je termosensitivní v extraktu z cdc2 ts in vitro Potvrzeno: CDC28 je taky kináza Kinázová aktivita v průběhu BC kolísá, ale s jediným vrcholem v nástupu mitózy (G2/M)
10
Molekulární charakteristika Cdc2p - obr.2 Synchroní kultury wt Prázdné body= %dělících se buňek Plné body= Cdc2p aktivita
11
Molekulární charakteristika Cdc2p Naklonovány geny wee1 a cdc25= upstreamově ovlivňují aktivitu Cdc2p Wee1p = fosforylační aktivita Cdc25p = antagonista Wee1p mitotického inhibitoru
12
Molekulární charakteristika Cdc2p -obr.3
13
Biochemická analýza fosforylace Cdc2p Cdc25p fosforyluje na pozici tyrosinu 15 Fosforylace je asociována s G2-fází když je aktivita Cdc2p nízká Tyrosin 15 je v blízkosti ATP binding site = ovlivňuje katalitickou aktivitu
14
Biochemická analýza fosforylace Cdc2p Potvrzeno= nefosforylovaný phenylalanine 15 mutant vchází předčasně do mitózy Cdc25p je vyžadován k odstranění Pi z tyrosinu 15 z Cdc2p Aktivita Cdc2p je regulována fosforylací = úroveň fosforylace je regulována Wee1p (mitotic inhibitor) a Cdc25p (mitotic activator)
15
Další regulace Cdc2p Gen cdc13 = podobný cyklinu z ježovky, což je regulátor časného embryonálního rýhování Cdc13p cyklin je nutný pro aktivaci Cdc2p k přechodu z G2 do M
16
Univerzální role Cdc2p v CCC Snaha o nalezení cdc2 homologu na základě strukturální podobnosti Problém: v lidském těle cca 500 kináz cDNA knihovna z člověka do cdc2 ts mutantů Nalezen lidský homolog cdc2 který je schopen plně nahradit cdc2 ts 63%homologie (1000-1500 M.years) BC a jeho cdc2 je hluboce konzervován
17
Univerzální role Cdc2p v CCC
18
MPF (maturation promoting factor) izolovaná z žabího vajíčka = 2 proteiny 32kD = homolog Cdc2p (Western blot a imunoprecipitace) MPF je stejný v žábě, hvězdici i kvasince Univerzální pro všechny eukaryota
19
Další důležité role CDKs Buňka musí projít každou fází BC jen jednou Řízeno G2/M CDK (Cdc2p/Cdc13p) V G2 blokují možný nástup S-fáze Overexprese spec. inhibitoru G2/M CDK (Ram1p) zároveň navodí více S-fází = buňky s vyšší ploidií Delece Cdc13p G2/M cyklinu má stejný účinek
20
Další důležité role CDKs
21
To je vše Děkuji za pozornost
Podobné prezentace
