Stáhnout prezentaci
Prezentace se nahrává, počkejte prosím
1
CHARAKTERIZACE DNA
2
CHARAKTERIZACE DNA QANTUM = kolik? KVANTIFIKACE QUALIS = jaký?
KVALIFIKACE SPECIES = druh SPECIFIKACE Proč tyto testy provádět? účinnost izolace optimalizace vstupního množství DNA do dalších analýz, zejména PCR Konfucius
3
Je těžké hledat černou kočku v temné místnosti. Zvláště když tam není.
4
Kvantita - několikero vzorečků
MOLEKULÁRNÍ HMOTNOST MW (dsDNA) = (počet bp) x 660 [Da] MW (ssDNA) = (počet b) x 330 [Da] PŘEPOČET µg ↔ pmol (dsDNA) pmol (dsDNA) = µg (dsDNA) x 1,515 / N (bp) µg (dsDNA) = pmol (dsDNA) x N (bp) x 6,6.10-4 PŘEPOČET µg ↔ pmol (ssDNA) pmol (ssDNA) = µg (ssDNA) x 3,030 / N (b) µg (ssDNA) = pmol (ssDNA) x N (b) x 3,3.10-4
5
Obsah DNA v buňce Celková DNA 6 pg Celková RNA 10-30 pg
Velikost genomu 2 x 3,3.109 bp Plazma Erytrocyty Leukocyty Trombocyty Počet v ml krve - 5. 109 Obsah DNA v ml krve něco málo… 30-60 µg Objem 2 a více ml koncentrace spermií 20 milionů v ml a více Obsah DNA v ml spermatu 60 µg a více
6
Kvalita DNA - degradace
fragmentace narušení struktury
7
Kvalita DNA - degradace
8
Kvalita DNA - inhibitory
9
specifita DNA
10
Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Měříme, kolikrát poklesne intenzita monochromatického světla procházejícího roztokem DNA Tλ = Ip / IV Aλ = -log Tλ = ελ · c · l Lambert – Beerův zákon transmitance absorbance
11
Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Absorpční maximum DNA λ = 260 nm
12
Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Pro forenzní použití je ale spektrofotometrie velmi nevhodná… Proč? malá senzitivita (nízké koncentrace nezachytí) nulová specifita (cokoli zvyšuje absorpci při 260 nm, je považováno za DNA) k měření jsou třeba velká množství izolátu
13
LUMINISCENCE MALÉ FYZIKÁLNÍ REWIEW „-SCENCÍ“
CHEMO- TERMO- ELEKTRO- KATODO- SONO- MECHANO- FOTO-
14
FOTOLUMINISCENCE fluorescence fosforescence
15
DETEKCE DNA – interkalační fluorofory
Nukleotidy a nukleové kyseliny obecně nefluoreskují. Výjimkou je kvasinková tRNAPE, která obsahuje vysoce fluorescentní bázi známou jako Yt-báze (emmax 470 nm). DNA je tedy jen slabě fluorescentní nebo nefluorescentní.
16
DETEKCE DNA – interkalační fluorofory
ethidiumbromid SYBR green
17
Kvantitativní detekce fluoroforů = fluorimetrie
PICO Green OLIGO Green
18
detekce specificky lidské DNA
Metoda je z logiky věci vždy založena na sekvenční specifitě
19
Kvantifikace specificky lidské DNA - blotting
izolát blotujeme na membránu hybridizujeme se specifickou sondou sondu nějak zobrazíme – čím silnější bude signál, tím víc sondy je navázáno, tzn. tím víc cílových sekvencí sonda našla = tím víc DNA α-satelitní DNA sekvence v lokusu D17Z1 QuantiBlot® Human DNA Quantitation Kit
20
Kvantifikace specificky lidské DNA - luminometrie
Alu-repetice (???) AluQuant™ Human DNA Quantitation System denaturujeme dsDNA na ssDNA hybridizujeme se specifickou sondou přidáme polymerázu s exonukleázovou aktivitou a pyrofosfát – sonda je odbourána, vznikají volné dNTP fosfát je přenesen pomocí kinázy na přidané ADP, vzniká ATP ATP je použito na luminiscenční enzymatickou reakci
21
real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
22
real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
23
real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
Emisní filtr Detektor Excitační Filtr Zdroj světla
24
real-time PCR kvantifikace – možné principy
nespecifické interkalační fluorofory SYBR green, EtBr hydrolyzační sondy TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“) hybridizační sondy LightCycler
25
real-time PCR kvantifikace
nespecifické interkalační fluorofory provádíme PCR specificky lidského lokusu (např. Alu) současně měříme fluorescenci (v roztoku je SYBR Green či jiná dye) čím více je dsDNA, tím větší je fluorescence je nutno mít ověřenou specifitu amplifikace!!!
26
real-time PCR kvantifikace – Sybr green
27
real-time PCR kvantifikace
hydrolyzační sondy hybridizační sondy TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“) LightCycler využívají tzv. FRET = Fluorescent (Förster) Resonance Energy Transfer λexcitA λemisA λemisB λexcitA Dye A Dye B
28
real-time PCR kvantifikace - TaqMan
29
real-time PCR kvantifikace - maják
30
real-time PCR kvantifikace - štír
31
real-time PCR kvantifikace - LightCycler
32
real-time PCR kvantifikace
plató exponenciální fáze CT
33
real-time PCR kvantifikace
34
real-time PCR kvantifikace
35
real-time PCR kvantifikace mohu měřit i přítomnost inhibitorů – jak?
neprovádím monoplex PCR, ale duplex PCR kvantifikovaný lokus kontrolní lokus
Podobné prezentace
© 2024 SlidePlayer.cz Inc.
All rights reserved.