Charakterizace slepičích protilátek proti sarkosinu

Prezentace na téma: "Charakterizace slepičích protilátek proti sarkosinu"— Transkript prezentace:

1 Charakterizace slepičích protilátek proti sarkosinu
Dagmar Uhlířová Datum konání: Investice do rozvoje vzdělávání

2 Osnova Sarkosin Protilátky proti sarkosinu ELISA
Paramagnetické částice Reálný vzorek Shrnutí Výhled do budoucna

3 Sarkosin Charakterizace Použití Hapten
1847 izolován Justusem von Liebigem Přírodní, netoxická, bezbarvá, pevná látka patřící mezi aminokyseliny Methylderivát glycinu nazýván také N-methylglycin Meziprodukt metabolismu cholinu Hapten Nekompletní antigen Nízká molekulová hmotnost Sám o sobě nevyvolává tvorbu protilátek Potřebuje nosič Použití Léčba schizofrenie Marker rakoviny prostaty

4 Slepičí protilátky ze žloutku
Vyrobeny firmou Hena s.r.o. IgY, polyklonální Produkovány ve vaječném žloutku Bez imunoafinitní purifikace Sarkosin byl přes oligopeptidové raménko konjugován k proteinu hemokyaninu (KLH)* Funkčnost byla ověřena pomocí reaktivity ke konjugátu sarkosin-BSA pomocí ELISA * Srovnání koncentrace IgY u slepic před a po imunizaci* Sar 1, Sar2 Rozeznávají tyto protilátky volný sarkosin? Jak to ověřit? Sar 1 Sar 2 kDa Mr Sar1 rSar1 Sar2 rSar2 25 37 50 75 100 150 260 20 10 HC LC Fab IgY Protilátka Číslo Protein (mg/ml) Reaktivita se sarkosin-BSA Sar 1 211112 19.4 dobrá Sar 2 251112 18.2 vynikající *Data od výrobce

5 ELISA Návrh uspořádání sendvičové metody Biotinylace protilátek
biotinamidohexanoyl-6-aminohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester Vortexovat 2 hodiny Dialyzace Úprava objemu Uchování s azidem sodným Ověření biotinylace pomocí streptavidinového konjugátu s enzymem Po biotinylaci Před biotinylaci Značená protilátka

6 ELISA Plate surface Blocking protein Sar1 antibody Sarcosine
Biotin Streptavidin-conjugated AP

7 Paramagnetické částice
Tosylová skupina(sulphonyl ester) 1000 µg ligand na 25 mg částic Acidifikace na pH = 2.5, 15 min Výměna pufru(Amicon 100 K) pH = 9.5, (NH4)2SO4, 24 hodin, při 37°C Blokování 0.5 % BSA Absorbance (AU)

8 ? Sar DB1 Sar DB2 Sar1-Sar1 Sar1-Sar2 Sar2-Sar2 Sar2-Sar1

9 Kalibrace na paramagnetických částicích
Sar1-Sar1 Sar1-Sar2 Sar2-Sar1 Sar2-Sar2

10 X Srovnání metod Metoda Kvantifikace
Nejnižší detekovaná koncentrace (nM) ELISA ano 15 Paramagnetické částice ne 0,625 X

11 Reálný vzorek-ELISA příprava vzorku vliv pufru
Na pufr - aminoanalyzátor TBS - ELISA AA (µM) ELISA (µM) 1:1000 moč v Na pufru 88 100 moč v TBS 67 50 1:2000 90

12 Reálný vzorek –paramagnetické částice

13 Shrnutí Protilátky reagují s volným sarkosinem
Jsou použitelné pro imunoanalýzu standardu sarkosinu Po imobilizaci na paramagnetické částice Detekce nižších koncentrací sarkosinu Nelze kvantifikovat Reálný vzorek Nutná optimalizace Vliv ředícího pufru Vliv značení

14 Výhledy do budoucna Použití jiného typu paramagnetických částic
Použití jiného značení Optimalizace podmínek pro reálný vzorek

15 Investice do rozvoje vzdělávání
Poděkování: Budování výzkumných týmů a rozvoj univerzitního vzdělávání výzkumných odborníků pro mikro- a nanotechnologie (NANOTEAM) CZ.1.07/2.3/.00/ Investice do rozvoje vzdělávání

16 Kolektiv Laboratoře metalomiky a nanotechnologií
Poděkování Prof. Ing. René Kizek, Ph.D. Ing. Soňa Křížková, Ph.D. Kolektiv Laboratoře metalomiky a nanotechnologií

17 Děkuji za pozornost