Elektroforéza fyzikálno-chemická metóda na separáciu látok nesúcich elektrické náboje látky sa vystavia pôsobeniu elektrického poľa, dochádza k pohybu.

Prezentace na téma: "Elektroforéza fyzikálno-chemická metóda na separáciu látok nesúcich elektrické náboje látky sa vystavia pôsobeniu elektrického poľa, dochádza k pohybu."— Transkript prezentace:

1 Elektroforéza fyzikálno-chemická metóda na separáciu látok nesúcich elektrické náboje látky sa vystavia pôsobeniu elektrického poľa, dochádza k pohybu molekúl ich pohyblivosť závisí od veľkosti náboja, veľkosti a tvaru molekúl, podmienok prostredia (napríklad charakter nosiča) a sily elektrického poľa delenie nukleových kyselín a proteínov pri separácii látok sa používajú ako nosiče najčastejšie agarózové a polyakrylamidové gély gély majú charakter molekulových sít, čo umožňuje, aby sa pri elektroforéze rozdelili aj látky, ktoré majú rovnaký náboj, ale rozličnú veľkosť molekúl podľa príslušného gélu rozlišujeme elektroforézu agarózovú a polyakrylamidovú (PAGE)

2 Elektroforéza v agarózovom géli
separácia a identifikácia NK delenie fragmentov DNA s veľkosťou ~ 20 – bp s rozlíšením ~ 5 bp (špeciálne typy agarózy, vo väčšine prípadov je rozlíšenie viac ako 5 bp) molekuly DNA sa pohybujú (DNA je záporne nabitá) v agarózovom géli od záporne nabitej katódy ku kladne nabitému pólu (k anóde) separujú sa na základe ich veľkosti (bázových párov) – malé molekuly DNA sa pohybujú rýchlejšie, veľké pomalšie

3 agaróza je lineárny polymér D-galaktózy a galaktózového derivátu (3,6-anhydro-L-galaktózy), ktorý sa získava purifikáciou agaru (výťažok z červených rias) pri príprave gélu sa agaróza rozpúšťa v horúcich tlmivých roztokoch (napríklad Tris-borátový alebo Tris-acetátový tlmivý roztok) ak teplota klesne pod 45 °C, vzniká polotuhý gél základné zariadenie na elektroforézu sa skladá z elektroforetickej komory a zdroja jednosmerného elektrického prúdu elektroforetická komora má katódový a anódový priestor s elektrolytom a priestor na umiestenie nosiča

4 vzorka DNA sa do gélu nanáša zmiešaná s farbivom (brómfenolová modrá, xyléncyanolová zelená)

5

6 do gélu sa pridáva interkalačné činidlo, ktoré sa počas migrácie DNA začleňuje medzi dusíkaté bázy DNA a po elektroforéze umožňuje pozorovanie jednotlivých fragmentov separovanej DNA v UV svetle vizualizácia DNA – pomocou fluoreskujúceho farbiva – etídiumbromid (EtBr) komplex EtBr s DNA po ožiarení UV lúčmi fluoreskujú oranžovo EtBr sa pridáva do agarózového gélu počas jeho prípravy EtBr je silné mutagénne činidlo, preto pri manipulácii s gélmi a roztokmi je nevyhnutné použiť rukavice!!!

7

8 veľkosť separovaných DNA fragmentov sa zisťuje porovnaním s markermi molekulových hmotností - súborom fragmentov DNA so známou veľkosťou v súčasnosti je komerčne dostupných mnoho rozličných markerov, výber vhodného markera závisí od konkrétnej aplikácie

9

10

11 Rýchlosť pohybu NK v géli závisí od niekoľkých faktorov:
veľkosť NK Menšie molekuly prechádzajú gélom rýchlejšie, ľahšie sa pohybujú v sieťovitej štruktúre gélu. Veľkosť jednotlivých prúžkov možno odčítať zo štandardu molekulových hmotností. Pri začiatku gélu sa DNA pohybuje pomalšie ako pri jeho konci, takže vzdialenosti medzi jednotlivými prúžkami v DNA ladderi nie sú proporcionálne. konformácia NK Sekundárne štruktúry DNA ťažšie prechádzajú gélom.

12 forma NK Superšpiralizované plazmidy sa pohybujú v géli pomalšie ako relaxované kruhové formy, pričom najrýchlejšie sa v géli pohybuje lineárna forma DNA. koncentrácia gélu Hustejší gél vytvára aj hustejšiu sieťovitú štruktúru, ktorá sa viac hodí na lepšiu separáciu menších fragmentov. napätie elektroforetickej aparatúry Čím vyššie je napätie, tým rýchlejšie prebieha separácia, ale zároveň sa tým uvolňuje viac tepla, ktoré zohrieva aparatúru a môže interferovať s delením. Vyššie napätie môže byť aj príčinou "rozmazaných" prúžkov.

13