Immunoprecipitace Praktická práce – část I.. Protokol k experimentu Protokol.

Prezentace na téma: "Immunoprecipitace Praktická práce – část I.. Protokol k experimentu Protokol."— Transkript prezentace:

1 Immunoprecipitace Praktická práce – část I.

2 Protokol k experimentu Protokol

3 1.1 Příprava roztoku protilátek AB roztok obsahuje 7,5 mg IgG/ml (celkový objem: 1ml) Pipetujte 100 µl roztoku protilátky ze žluté zkumavky(AB) do červené(AB) Pipetujte 900 µl roztoku NaCl do červené zkumavky(AB) Promíchejte AB roztok opakovaným natažením do pipety a vypuštěním. Pozor! Při nasávání roztoku mačkejte pipetu jen do první polohy, jinak by mohlo dojít k nasátí vzduchu. 1. Příprava experimentu

4 1.2 Ředění antigenního roztoku Pipetujte 40 µl z fialové zkumavky (AG) do modré (AG) 960 µl roztoku NaCl pipetujte do modré zkumavky (AG) Promíchejte AG roztok opakovaným natažením do pipety a vypuštěním. 1. Příprava exprimentu

5 2.1 Pipetujte do každé jamky mikrotitrační destičky (označeny 1 – 7) 100 µl roztoku NaCl. 2.2 Pipetujte 200 µl AG roztoku z modré zkumavky do jamky 8 87654321 200 µl AG 2. Sériové ředění

6 2.3 Pipetujte 100 µl AG z jamky 8 do jamky 7 2.4 Obsah 7. jamky promíchejte několikanásobným natažením do pipety a opětovným vypuštěním Pozor! Při nasávání roztoku mačkejte pipetu jen do první polohy, jinak by mohlo dojít k nasátí vzduchu. 876 5 4321 200 µl AG 2. Sériové ředění

7 2.5 Pipetujte 100 µl AG z jamky 7 do jamky 6. 2.6 Obsah 6. jamky promíchejte opakovaným natažením do pipety. Stejným způsobem pokračujte až k jamce 1. 2.7 Odeberte 100 µl z jamky 1. 100 µL 876 5 43 21 100 µl odebrat 2. Sériové ředění

8 2.8 Do každé jamky přidejte pipetou 100 µl AB z červené zkumavky. 2.9 Nechejte stát 5 minut při pokojové teplotě. 2. Sériové ředění Jaká koncentrace AG je v jednotlivých jamkách?

9 Analýza protilátek Praktická práce - část II

10 Připravte si zkumavky dle následující tabulky 1. Příprava zkumavek pro PAGE

11 1.1 Ze zelené zkumavky (LÄ) pipetujeme 25 µl Lämmli-pufru do každé zkumavky (označeny 1-9). 1.2 Pipetujeme 15 µl H 2 O do zkumavky 1, 2, 4, 5, 7 a 8; a 5 µL H 2 O do zkumavek 3, 6 a 9. 1.3 Obsah zkumavky 4 promícháme opakovaným natažením do pipety a opětovným vypuštěním. Ze zkumavky 4 pipetujte po10 µl roztoku do zkumavek 1, 2 a 3. 1.4 Z červené zkumavky (AB) pipetujeme 10 µl protilátek do zkumavek 4, 5 a 6. 1. Příprava vzorků pro PAGE

12 1.4Z modré zkumavky (AG) pipetujte 10 µl antigenu do zkumavek 7, 8 a 9. 1.5Ze žluté zkumavky (DTT) pipetujte 10 µl dithiotreitolu do zkumavek 3, 6 a 9. 1. Příprava zkumavek pro PAGE

13 1.6 Vložte zkumavky 2, 3, 5, 6, 8 a 9 na pět minut do termobloku vyhřátého na 95°C ZkumavkaTeploDTT AB/AG1-- 2+- 3++ AB4-- 5+- 6++ AG7-- 8+- 9++ 1. Příprava zkumavek pro PAGE

14 2. Příprava gelové kazety 2.1Otevřete balení PAGE gelu odstřihnutím okraje podél černé čáry a vyjměte gelovou kazetu.

15 2.2 Skalpelem rozřízněte lepící pásku na gelové kazetě podél označené linie a odstraňte spodní proužek. 2. Příprava experimentu

16 3.1 Gelovou kazetu vložte kratší destičkou do elektrodového držáku. Na druhou stranu vložte druhou gelovou nebo prázdnou kazetu. 3.2 Elektrodový držák zasuňte do upínacího rámečku a zajistěte svorkami. 3.3Upínací rámeček s elektrodovým držákem vložte do elektrodové vany. 3. Příprava elektroforézní komory

17 4.1Komoru v elektrodovém držáku naplňte TGS pufrem až po okraj. 4.2Do elektrodové vany nalijte 800 ml TGS pufru. 4.3Odstraňte hřebínek. 4. Plnění komory pufrem

18 Naplňte gelové jamky: - 20 µL ze zkumavky (1) - 20 µL ze zkumavky (2) - 20 µL ze zkumavky (3) - 5 µL kaleidoskopický standard (KS) - 20 µL ze zkumavky (4) - 20 µL ze zkumavky (5) - 20 µL ze zkumavky (6) - 20 µL ze zkumavky (7) - 20 µL ze zkumavky (8) - 20 µL ze zkumavky (9) ABAGAB/AGKS 5. Plnění gelových jamek

19 6.1Zavřete aparaturu a spusťte elektroforézu na 150 V. 6.2Zastavte elektroforézu, když proužek reaktantů doputuje do spodní části gelu. 6. Provedení elektroforézy

20 7.1 Z aparatury vyjměte upínací rámeček a z komory vylijte pufr do elektrodové vany ( Pufr se dá použít opakovaně!) 7.2 Vyjměte gelové kazety. 7. Vyjmutí gelu

21 8.1Odstraňte skleněné destičky a gel umístěte do barvící misky. 8.2 Před vlastním barvením promývejte gel po 2 minuty vodou. Potom vodu vylijte. 8.3Obarvěte gel přidáním 100 ml barvícího roztoku (Coomassie) max na 30 minut. 8.4 Barvící roztok slijte do skladovací láhve a přidejte tam 100 ml vlažné vody. 8.5 Gel vložte do míchačky. 8. Barvení proteinů

22 Tab.: Molární hmotnost proteinu v Kaleidoskopo vém sloupci 9.1 Vytvořte kalibrační čáru pomocí kaleidoskopového sloupce. ProteinBarvaM myozinModrá201090 Da ß-galaktosidázaPurpurová133730 Da hovězí albumin Zelená 83559 Da Carbon anhydraseFialová 39559 Da Soybeans trypsin inhibitorOranžová 31405 Da LysozymČervená 17408 Da AprotininModrá 7081 Da 9. Analýza

23 9.2 Určete molekulární hmotnost proužků v každém sloupci. Který proužek náleží kterému proteinu? 9. Analýza