Metody testování buněčné imunity

Buněčná imunita Bílé krvinky – leukocyty Nespecifická imunita: Neutrofily Eozinofily Bazofily Makrofágy NK buňky Specifická imunita T lymfocyty B lymfocyty

Jak pracovat se vzorkem krve? Nesrážlivá krev – antikoagulans Dodat do 2h Zpomalení „stárnutí“ a aktivity při 4°C Funkční testy – neporušené buňky Vitalita → šetrná rychlá práce →

Co jsme schopni sledovat? (1/2) Vlastnosti Biologické Velikost Granularita Viabilita Chemické pH Fyzikální Membránový potenciál Zastoupení (počty) jednotlivých populací Fenotypizace

Co jsme schopni sledovat? (2/2) Aktivita jednotlivých buněk Přímo – Průkaz samotné funkce Nepřímo – Exprese specifických molekul př.: Aktivační markery – Exprese specifických produktů př.: Cytokiny Reaktivní kyslíkové intermediáty - oxidační vzplanutí Enzymy DNA

Průtoková cytometrie Současné měření vlastností buňky (částice) při průchodu laserovým paprskem Fyzikálních Chemických Biologických Měření každé buňky (částice) nejde o průměrné hodnoty měřené suspenze ↓ Kvalitativní i kvantitativní Analýza až 10000 b.(částic) / s

Lom světla (FCS x SSC) Buňky obaleny pláštěm nosné tekutiny Pod tlakem hnány do speciálního prostoru Lom světla po průchodu proudem suspenze – sledování směru úhlu lomu Přímý rozptyl (FSC) Lom o 2°-13° – úměra velikosti buňky Boční rozptyl (SSC) Rozptyl o 90° – indikátor buněčné struktury – – granularita

Analýza značených buněk (1/3) Pomocí fluidního systému Buňky obaleny pláštěm nosné tekutiny Pod tlakem hnány do speciálního prostoru Setkání laserového paprsku s procházející buňkou

Analýza značených buněk (2/3) Optický systém Excitační část Laser Soustava čoček a hranolů – usměrnění světelného paprsku Sběrná část Optická zrcadla + filtry – detekce světelných kvant specifické vlnové délky

Analýza značených buněk (3/3) Elektronický systém Převod optického signálu na elektronický Digitalizace pro počítačovou analýzu → datový soubor

Grafické zobrazení měřených veličin (1/2) Jednoparametrový histogram Osa x – intenzita signálu Osa y – počet měřených buněk

Grafické zobrazení měřených veličin (2/2) Dvouparametrový histogram Osa x – intenzita 1. signálu Osa y – intenzita 2. signálu Počet měřených buněk Dot plot – hustota bodů Contour plot – hustota odpovídá čarám připomínajícím vrstevnice

Testy buněčné imunity

Detekce buněk, struktur, molekul pomocí protilátek →

Fenotypizace buněk Charakterizace buněk pomocí specifických membránových či cytoplazmatických markerů Využití reakce antigen-protilátka Vizualizace → fluorochrom

Fenotypizace leukocytů pomocí CD znaků CD znaky = systematické označení většiny povrchových molekul leukocytů Znak Buněčná populace CD45 leukocyty CD3 lymfocyty CD3/CD4 Th (pomocné) lymfocyty CD3/CD8 Tc (cytotoxické) lymfocyty CD19 B lymfocyty CD16/CD56 Natural Killers CD203 Bazofily Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56bright subset Megan A. Cooper,  Todd A. Fehniger, Sarah C. Turner, Kenneth S. Chen, Bobak A.Ghaheri,  Tariq Ghayur, William E. Carson, and  Michael A. Caligiuri

Analýza značených buněk (2/3) Optický systém Excitační část Laser Soustava čoček a hranolů – usměrnění světelného paprsku Sběrná část Optická zrcadla + filtry – detekce světelných kvant specifické vlnové délky

Grafické znázornění Obr.1 Fenotypizace Th lymfocytů Obr.2 Fenotypizace Tc lymfocytů Obr.1 Fenotypizace Th lymfocytů Obr. 4 Fenotypizace NK buněk Obr.3 Fenotypizace B lymfocytů

Funkční testy leukocytů – Aktivace bazofilů (1/2) Stanovení míry alergické reakce Identifikace bazofilů znakem – CD203c Identifikace aktivovaných bazofilů – CD63 U klidových stádií bazofilů – CD63 součástí membrány granul obsahujících histamin Aktivace bazofilů → splynutí granul s cytoplazmatickou membránou = vystavení molekuly CD63 na buněčný povrch Podle některých autorů IL-3 působí pozitivně i na expresi znaku CD63 a tím se zvyšuje senzitivita testu. To je přínosné především pro alergeny, kterénevyvolávají silnou aktivaci. Na druhou stranu prestimulace s IL-3 způsobuje nespecifické zvýšení výsledků u testu založeném na měření aktivace pomocí znaku CD203c.(Ebo aj. 2008)

Postup testu aktivace bazofilů Inkubace vzorku krve s IL-3 Podpora stimulace bazofilů – př. zvýšené uvolnění histaminu Možnost zvýšení exprese CD63 → zvýšení senzitivity testu Inkubace vzorku krve s alergenem Aktivace bazofilů Značení molekul: CD203c CD63

Funkční testy leukocytů (2/2) – Cytotoxický test Cytotoxicita = schopnost T lymfocytů a NK buněk zabíjet nádorové a infikované buňky př.: Cílové buňky – 51Cr Zabití = uvolnění 51Cr Měření radioaktivity supernatantu

Význam testování lymfocytárních populací Monitorování buněčné imunity Sekundární imunodeficity Traumata Sepse Pooperační stavy Diagnostika a prognostika zhoubných nádorů Diagnostika SCID a hypogamaglobulinémie Monitorování rozvoje štěpu po transplantaci kostní dřeně Testování nových léků (farmakologie, protinádorová imunoterapie)

Proces pohlcování pevných částic buňkou Fagocytóza Proces pohlcování pevných částic buňkou Fáze fagocytózy Diapedéza Chemotaxe Ingesce Usmrcení a destrukce fagocytovaných částic

Testy fagocytárních funkcí Exprese adhezívních molekul Adherence k povrchu Reakce antigen-protilátka Př. FACS Chemotaxe Ingesce Inkubace plné krve s polymerovými partikulemi nebo bakteriemi Fagocytóza partikulí nebo bakterií Vyhodnocení ve světelném mikroskopu chemotaxin (fMLP) suspenze testovaných buněk médium Chemotaxe

Testy fagocytárních funkcí Oxidační vzplanutí = schopnost tvořit reaktivní kyslíkové radikály Kyslíkové radikály – reakce se substrátem → detekce barevného substrátu FACS: dihydrorhodamin → rhodamin Mikroskopicky, spektrofotometricky bezbarvá diazoniová sůl (př.NBT) → formazan Substrát proniká do b K testům redukce tetrazoliových solí se používá dvou substrátů- nitroblue- tetrazolium chlorid (NBT) a jodonitrotetrazolium (INT). Tyto testy jsou založeny na schopnosti redukovat bezbarvé tetrazoliové soli na barevný formazan, který se ukládá ve formě krystalů v cytoplazmě granulocytů. Test lze hodnotit jednak mikroskopicky, kdy je výsledek vyjádřen jako procento pozitivních buněk, nebo přesněji fotometricky po provedené extrakci formazanu. V případě poruch v oxidačních mechanizmech je test nulový či negativní. V současné době je doporučeno ověřit a zpřesnit výsledek testu dalšími testy, např. chemiluminiscencí. uňky

Baktericidní test Testuje všechny fáze fagocytózy Inkubace plné krve (obsahuje opsoniny) s bakteriemi (C. albicans, S.aureus, E.coli ) Hodnocení schopnosti usmrtit mikroorganismy Očkování mikroorganismů na půdu – počítání kolonií Mikroskopicky – vitální barvení (trypanová modř = = mrtvé mikroorganismy) vitálním barvení trypanovou modří (obarví se usmrcené mikroorganismy). Je-li třeba znát počet živých a mrtvých buněk ve vzorku, přidá se k buněčné suspenzi před počítáním barvivo, které neprochází intaktní buněčnou membránou, nebo je z intracelulárního prostoru aktivně transportováno ven. Nejčastěji se používá roztoku trypanové modři. Živé buňky zůstanou bezbarvé, zatímco mrtvé buňky, u nichž je porušena integrita buněčné membrány a jejích transportních mechanismů, se rychle zbarví na modro.

Význam testování fagocytózy FUNKCE TEST PORUCHA ADHEZE Exprese CD11/ CD18 LAD1 syndrom CHEMOTAXE Migrace pod agarózou Poruchy jsou poměrně vzácné; transientní jsou u infekcí, popálenin, traumatu INGESCE Opsonizace a pohlcení částic (metakrylátové partikule, mikroorganismy) Projeví se u poruch opsonizace RESPIRAČNÍ VZPLANUTÍ NBT Defektní u chronické granulomatózní choroby (CGD); transientní porucha u infekcí, traumatu, malnutrice Fluorescence Chemiluminiscence CELÝ PROCES FAGOCYTÓZY VČETNĚ USMRCENÍ MIKROORGANIZMU Baktericidní test Upozorní na poruchu některého z kroků fagocytózy (Litzman a spol., 2007)

Děkuji za pozornost