Základy cytogenetiky Chromozomy a karyotyp člověka

Historie studia chromozomů: r.1903 Sutton,Boveri - průkaz jejich souvislosti s dědičností r.1956 Tjio, Levan – 46 chromozomů u člověka r.1959 Lejeune – první chromozomální abnormalita Downův syndrom = trisomie 21.chromozomu

Karyotyp = soubor všech chromozomů v jádře buňky Karyotyp člověka V buněčných jádrech určitého organismu a druhu je konstantní do počtu, velikosti i tvaru chromozómů Karyotyp člověka muž 46, XY, žena 46 XX 22 párů autozomů (homologní – 1 od otce, 1 od matky) 1 pár gonozomů (heterochromozómů)

Morfologie lidských chromozomů metacentrický submetacentrický akrocentrický centromera chromatidy telomera satelit sat. stopka (NOR) p q p = krátké rameno q = dlouhé rameno NOR = oblast organizátoru jadérka (rRNA geny)

Telomery koncové oblasti chromozomů opakované sekvence nukleotidů TTAGGG ochrana chromozomu před spojováním kohesivních konců, stabilizace konců chromozomů zkracování sekvencí při každém dělení buňky-limitující faktor počtu dělení enzym telomeráza zajišťuje tvorbu telomer, jeho abnormální aktivita prokázána v nádorových buňkách Jeho

Detekce telomerických sekvencí metodou FISH (telomerické sondy) Applied imaging katalog 1997 Detekce telomerických sekvencí metodou FISH (telomerické sondy) Vpravo nahoře - myší chromozomy (telocentrické)

Ultrastruktura chromozomů: Složení chromatinu: DNA histony = bazické bílkoviny: H1,H2A, H2B,H3,H4 nehistonové bílkoviny = neutrální n. slabě kyselé celková délka DNA asi 2 m lidské chromozomy obsahují cca 30 000 strukturních genů

Organizace interfázního chromatinu Nukleozom: jádro z oktameru histonů H2A,H2B,H3,H4 obtočené dvoušroubovicí DNA = nukleozom spojka mezi nukleozomy = vlákno DNA volné nebo asociované s H1 histonem (utažení vlákna) = kondenzace na 1/10 nativní DNA délky

Kondenzace chromatinu do chromozomů řetězec nukleozomů stočen do solenoidu (1 závit 6 nukleozomů) solenoid je skládán do smyček přichycených na nehistonových proteinech = nonhistone protein scaffold (Laemli loops) Chromozomy v metafázi - nonhistone protein scaffolds se smyčkami DNA jsou spiralizovány do spirální struktury chromatid zkrácení DNA vlákna 1/10000 nativní délky

Figure © 2004 by Griffiths et al. , http://www. mun

Chromatin Euchromatin despiralizován v interfázi spiralizován v mitoze obsahuje strukturní geny Heterochromatin repetitivní sekvence neobsahuje strukturní geny v interfázi poněkud spiralizován – barvitelný

Heterochromatin konstitutivní - v centromerických oblastech všech chromozomů - heterochromatinové bloky na 1q, 9q, 16q, Yq (Y chromatin) variabilita heterochromatinových částí chromozomů vznikla nerovnoměrným crossing-overem fakultativní = strukturně euchromatin, chová se jako heterochromatin Inaktivní X = sex chromatin=Barrovo tělísko, jeden ze dvou X chromozomů u samic savců, je inaktivní pozdější replikace v S fázi, (inaktivní X - replikace na konci S)

X-inaktivace, hypotéza Lyonové U samic savců pouze jeden X aktivní, druhý (a případně všechny další) inaktivní (metylován) = kondenzován v interfázi = barvitelný Inaktivace začíná v časném embryonálním vývoji (ve stádiu blastocysty) Inaktivace je náhodná (z hlediska rodičovského původu X), žena = mozaika buněk s inaktivním otcovským a mateřským X Inaktivace je pak stabilní v liniích dceřinných buněk Inaktivace je reversibilní - v oogenezi jsou obě X aktivní

Inaktivace je neúplná některé geny na Xp, i na Xq nejsou inaktivovány strukturně abnormální X - nenáhodná inaktivace balancované chomozomální abnormality (žádný materiál nepřebývá, nechybí) – přednostně normální X se inaktivuje je-li X/A translokace balanc. chromozomální abnormality nebalancované – abnormální X je přednostně inaktivní, důsledek selekce

Inaktivační centrum v lokusu Xq133, gen XIST- jeho produkt (mRNA) řídí inaktivaci (v cis poloze), je exprimován jen na inaktivním chromozomu Metoda vyšetření sex chromatinu = orientační ke stanovení pohlaví u sportovců

Figure after M. Barr (1963) by SM Carr; all text material © 2009 by Steven M. Carr http://www.mun.ca/biology/scarr/Barr_Bodies.html

XM XP X inaktivace

Metody studia lidských chromozomů – cytogenetické metody chromozomy lze sledovat pouze v dělící se buňce! Postnatální: kultivace periferních lymfocytů postižených, či jejich příbuzných Nasazení plné krve (s heparinem,) do kultivačního media se sérem a PHA (=phytohemagglutinin=mitogen) -stimuluje především T lymfocyty Kultivace 48, 72 nebo 96 hodin

zastavení mitotického dělení kolchicinem (působí na dělící vřeténko)- centrifugace sediment resuspendován v hypotonickém roztoku- centrifugace sediment resuspendován ve fixačním roztoku centrifugace a opakování fixace konečný sediment kápnut na podložní sklo-sušení a barvení

Kultivace a zpracování periferní krve pro chromozomální vyšetření Medium Serum PHA Krev Antib. Kultivace 72hod Kolchicin 1,5hod 0,075MKCl - lyze Hypotonie centrifugace metanol/octová Fixace Fixace-centrifugace celkem 3x - promytí něk.kapek na podl.sklo

Prenatální metody pro prenatální stanovení karyotypu plodu Kultivace buněk plodové vody (buňky odloučené z těla plodu) dlouhodobá kultivace (9-14 dnů)- buňky rostou přisedlé na dně kultivační nádoby v koloniích před cytogenetickým zpracováním stažení buněk trypsinem ostatní postupy podobné (hypotonie, fixace)

Buňky plodové vody – kultivován sediment buněk dlouhodobě = tkáňová kultura – buňky tvoří kolonie přichycené na dně kultivační nádoby Před stažením se přidá kolchicin, po stažení buněk z povrchu kultivační nádoby trypsinem zpracování cytogenetickou metodou

2. Vyšetření buněk choriových klků přímá metoda, nebo krátkodobá kultivace x dlouhodobá kultivace odběr v 10. týdnu gravidity rozstříhání očištěné tkáně (event.rozvolnění buněk trypsinem) a nasazení do kultivačního media, kultivace a cytogenetické zpracování vyšetřuje se extraembryonální tkáň – určité riziko diskrepance s karyotypem plodu

http://www.bartleby.com/107/pages/page62.html

3. Kultivace pupečníkové krve podobné jako periferní krev odběr krve z kličky pupečníku krátkodobá kultivace a cytogenetické zpracování

Barvení Klasické - obarvení Giemsou neodliší jednotlivé chromozomy - vhodné pro mutagenní studie Diferenciační barvení (pruhovací metody) odliší jednotlivé chromozomy dle charakteristických pruhů vhodné pro studium vrozených chromozomálních abnormalit numerických i strukturních, chromozomálních změn u nádorů

Klasické barvení k detekci získaných chrom. aberací Dicentrický chromozom + difragment

Barvení Metoda G pruhů působení roztoku trypsinu (enzymatická metoda) nebo solných roztoků před vlastním obarvením –různé chromozomální části různě denaturovány trypsinem a odlišně se barví Giemsou Metoda R-pruhů působení solných roztoků za vyšší teploty a vyššího pH → pruhování opačné k G pruhům (tmavé G pruhy jsou v R pruzích světlé)

Karyotyp ženy 46,XX – G pruhy

Karyptyp muže - 46,XY – G pruhy

R- pruhy

Barvení Metoda barvení heterochromatinu – C pruhy silná denaturace euchromatinových částí: HCl, BA(OH)2 + solné rotoky za vyšší teploty, Giemsou se pak barví pouze heterochromatinové bloky včetně centromer (jsou resistentnější) – vhodné pro studium heterochromatinových variant

C- pruhy

FISH metody = fluorescenční in situ hybridizace Hybridizace sondy značené fluorescenčním barvivem s chromozomy na cytogenetickém preparátu- vhodné pro detekci složitějších strukt.přestaveb, mikrodelecí, vhodné i pro detekci změn v nádorových buňkách i interfazních (např. lze sledovat fuzované onkogeny bcr/abl), k detekci aneuploidií v interfázních b.(bez kultivace) apod.

Proby: -satelitní = centromerické –detekují centromery vybraných chromozomů – vhodné k detekci aneuploidií v nedělící se buňce, k detekci tzv.”marker chromozomů”(chrom.neznámého původu) lokus specifické – pro určité lokusy na chromozomech- vhodné pro mikrodelece, k detekci onkogenů apod. malovací – barví celý chromozom – vhodné pro strukturní aberace

Detekce počtu chromozomů -satelitní sondou

Detekce fuzovaných genů lokus specifickými sondami VYSIS katalog 1996/1997- Products of genomic assessment

Detekce mikrodelece lokus specifickou sondou VYSIS katalog 1996/1997- Products of genomic assessment Detekce mikrodelece lokus specifickou sondou

Použití malovacích sond Cambio katalog – Star fish chromosome painting Použití malovacích sond

Použití malovací sondy k detekci strukturní přestavby

Applied imaging katalog 1997 M FISH

VYSIS katalog 1996/1997- Products of genomic assessment M - band