Mutageny a karcinogeny v životním prostředí RNDr Z Mutageny a karcinogeny v životním prostředí RNDr Z.Polívková Přednáška č.519 – kurz:Vývoj buněk a tkání

Historie mutageneze: 1928: Müller, X-ozáření – mutace u Drosofily 1946: Auerbachová a Robson: mutagenita yperitu 1945: Hirošima, Nagasaki

Mutace = náhlá, neusměrněná, trvalá změna genetického materiálu změna v primární struktuře DNA

Genotoxicita – vazba na DNA – addukty, chemické modifikace Genotoxicita – vazba na DNA – addukty, chemické modifikace bazí, zlomy DNA DNA a chromozomální poškození souvisí se vznikem nádorů (každý mutagen = potenciální karcinogen) Individuální vnímavost na genotoxické poškození (polymorfismus genů metabolismu xenobiotik a DNA reparace) = individuální riziko nádorového onemocnění. Oprava DNA lézí indukovaných expozicí mutagenním a karcinogenním faktorům nutná pro udržení stability genomu

Neopravené DNA poškození, mutace: apoptóza (programovaná buněčná smrt) stárnutí apoptóza (programovaná buněčná smrt) nekontrolované buněčné dělení

Exogenní DNA poškození příklady mutagenů/karcinogenů Pesticidy př. DDT Průmyslové sloučeniny př. PCBs, Vzdušné polutanty př. benzo(a)pyren, Mykotoxiny př. AFB1, ochratoxin A Těžké kovy př. Chr, As, Cd Fyzikální faktory UV, ionizující záření Endogenní DNA poškození reaktivní molekuly kyslíku, dusíku… chyby v replikaci, reparaci…

DNA poškození Exogenní faktory: UV záření: - dimery = kovalentní vazby pyrimidinů (C,T) - volné radikály Ionizující záření - volné radikály - jedno a dvouvláknové zlomy DNA vláken Chemické látky - alkylace bazí - addukty (prokarcinogeny metabolizovány na reaktivní molekuly) Chemicky modifikované báze mají odlišné párovací schopnosti při replikaci

Endogenní poškození: hydrolýza – odštěpení báze (depurinace, depyrimidinace) deaminace (např. deaminace C→U – neopravený U při replikaci chybně čten jako T) metylace a deaminace – deaminace metyl C →T = mutace C →T oxidace – (reaktivní formy O vznikají během metabolismu)→ oxidace bazí (př.oxo-G se páruje s A → bodová mutace C → A) odštěpení báze (depurinace, depyrimidinace) zlomy DNA zlomy DNA vláken – vznikají při běžných buněčných procesech, např . jako mezistupeň excizní reparace aj. chyby v replikaci, neopravené „proofreading“ aktivitou DNA polymerázy

oxidované baze, zlomy DNA přímo působící metab. aktivace DNA cyt P-450 detoxifikace epoxidy Addukty DNA bazí oxidované baze, zlomy DNA volné radikály Záření ioniz. apoptóza b.smrt DNA replikace spontánní nebo enzymatická oprava Mutace Chromozomál. aberace Repair BER, NER oprava DSB 0 mutace R. Štětina,2007

Odpověď buňky na poškození DNA- DNA reparace Odpověď Mechanizmus Přímá reverze poškození DNA: enzymatická fotoreaktivace - štěpení dimerů přímá ligace zlomů DNA odštěpení metylové skupiny metyltransferázou Léze na 1 vlákně DNA: Excize poškození DNA Bázová excisní oprava (BER) Nukleotidová excisní oprava (NER) Oprava chybného párování bazí – “mismatch repair" (MMR) Oprava dvouvláknových zlomů DNA: Nehomologní spojení zlomených konců - NHEJ Homologní rekombinace - HR „Single strand annealing“ - SSA

Bazový excizní repair – BER Oprava oxidovaných, hydroxylovaných,deaminovaných, metylovaných bazí, tj. poškození vzniklá v průběhu metabolických procesů (poškozen 1 nukleotid) Chybná baze odstraněna glykozylázou Min. 10 různých enzymů specificky opravujících různé typy lézí glykozyláza AP endonukleáza Abazické místo odstraněno endonukleázou polymeráza, ligáza gap zaplněn DNA polymerázou β a spojen ligázou

Nukleotidový excizní repair - NER Opravuje léze způsobené zevními mutageny (př. addukty, dimery..) - min. dva poškozené nukleotidy a narušení struktury řetězce endonukleáza Incize v blízkosti poškozeného místa endonukleázouu exonukleáza Odstranění poškozeného místa (oligonukleotidu) exonukleázou polymeráza DNA polymeráza δ a ε zaplní mezeru ligáza Spojení ligázou

NER Cca 30 proteinů účastnících se NER (XPA-G, CS geny) NER probíhající v chromatinu předpokládá remodelaci chromatinu a nukleozomů před započetím reparace = globální genomový repair GG-NER Reparace v aktivně transkribovaných částech se mírně liší, je rychlejší = „transcription coupled“ repair TC-NER - repair spojený s transkripcí Syndromy spojené s poruchou v NER: Xeroderma pigmentosum Trichothiodystrofie Cockayne syndrom (TC-NER)

„Mismatch repair" (MMR) = opravuje chyby v párování bází a inzerce nebo delece, vzniklé během replikace a neopravené „proofreading“ aktivitou DNA polymerázy = oprava normálních, ale chybně zařazených nukleotidů v nově syntetizovaném řetězci DNA - rozpoznání chyby a incize v blízkosti chyby endonukleázou - odstranění části DNA exonukleázou až k místu chyby - resyntéza DNA polymerázou δ a spojení Několik proteinů (MSH.., MLH.., PMS..) Porucha MMR: (zárodečná mutace v MMR genu + somatická mutace druhé alely)→ hereditární nepolypozní nádor tlustého střeva (HNPCC) - spojen s tzv. mikrosatelitní nestabilitou = změna v délce opakování sekvence 1-5 nukleotidů, způsobené inzercí/delecí nukleotidů

Oprava dvouvláknových zlomů DNA Vznik dvouvláknových DNA zlomů (DSB): endogenní vznik: oxidativní metabolismus topoizomerázy (SSB=jednovláknový zlom,DSB= dvouvláknová zlom) DNA replikace, reparace DNA rekombinace – c.o. v meioze V(D)J rekombinace Ig genů faktory exogenní: záření (ionizující, UV), chemické látky restrikční endonukleázy DSB indukovány přímo – ionizující záření nebo nepřímo – UV záření, chem.látky + enzymatický repair – SSB → DSBDSB

Oprava DSB : NHEJ = nehomologní spojování konců – hlavně v G0, G1 - bez přítomnosti homologního templátu - náchylnější k chybám HR = homologní rekombinace - vyžaduje přítomnost sesterské chromatidy (v G2, S fázích b.cyklu) nebo homologního chromozomu (meiotic.rekombinace) SSA = „single strand annealing“- vyžaduje homologní sekvence na tomtéž chromozomu – náchylný k chybám 2 hlavní mechanismy: NHEJ a HR – schopny bezchybné opravy DSB -ale i mutace a chromozomální aberace jako důsledek chybné reparace Mutace v genech DSB reparace: Ataxia teleangiectasia, Nijmegen breakage syndrom, Fanconi anemia, trichothiodystrofie, cancers

Oprava DSB : 2) NHEJ = nehomologní spojování konců („nonhomologous end joining“) může probíhat ve všech stadiích buň.cyklu, výlučný mechanismus opravy v G0,G1 - bez přítomnosti homologního templátu spojení i bez přítomnosti sekvenční homologie na zlomených koncích - náchylný k chybám takto probíhá i V(D)J rekombinace imunoglobulinových genů, izotypový přesmyk Spojení zlomů na různých chromozomech → CHA (translokace, dicentry…) Geny: XRCC4, heterodimer proteinů Ku 70/Ku80 ...

Oprava DSB : 1) HR = homologní rekombinace (rekombinační reparace) - vyžaduje přítomnost sesterské chromatidy (v G2, S fázích b.cyklu) nebo homologního chromozomu (meiotic.rekombinace) HR – relativně bezchybná – v meioze = crossing-over - v mitóze mezi sesterskými chromatidami Řízení HR: mnoho genů např. BRCA1, BRCA2 XRCC1,XRCC2,NBS1,Rad 51 geny aj.

Oprava dvouvláknových zlomů DNA homologní rekombinací DSB Zlom Hollidayovy smyčky a spojení Nukleáza odštěpí nukleotidy za vzniku jednovláknových konců Rad51 Vazba proteinu Rad 51 Rad51 Invaze řetězců a párování poškozeného vlákna DNA s intaktním , které slouží jako templát-vzor DNA polymeráza doplní mezery Dle Sumner 2003

3) SSA-“single strand annealing“ využívá sekvenční homologie na stejném chromozomu (nebo mezi různými chromozomy) – proto náchylnější k chybám (v savčím genomu mnoho repetitivních sekvencí, jako Alu, LINE ) exonukleáza odštěpí nukleotidy z jednoho řetězce na obou stranách zlomu za vzniku jednovláknových konců, ty vyhledají homologní sekvence na tomtéž chromozomu (nebo jinde), pak přebytečné části odstraněny a konce spojeny - Náchylné k chybám - ztráty částí DNA na jednom nebo obou koncích zlomů (delece)

Pozdní biologický efekt genotoxicity = nádory Důsledek neopraveného nebo chybně opraveného DNA poškození (DSB) → strukturní aberace chromozomů = časný biologický efekt genotoxicity Pozdní biologický efekt genotoxicity = nádory

CHROMOZOMOVÉ MUTACE=CHROM.ABERACE Typ aberace závisí na: typu (klastogenního) agens fázi b. cyklu, ve které působí př. ionizující záření: ozáření lid.lymfocytů in vitro (G0 fáze) - po kultivaci - aberace chromozomového typu (dicentry a ringy, zlomy obou chromatid) po ozáření v G2 fázi – chromatidové aberace ionizující záření= na S fázi nezávislé chemické látky – aberace chromatidové, vznik při replikaci závislé na S fázi buň. cyklu

Dicentrický chromozom + difragment = typická aberace po ozáření

Zlomy chromozomů - po chemických látkách

Chromatidová výměna – typická aberace pro chemické látky

Frekvence dicentrů zjištěná po ozáření neznámou dávkou - využití k biologické dozimetrii radiační expozice ale dicentry = nestabilní aberace !!! Frekvence translokací stabilní po mnoho let – retrospektivní dozimetrie (metoda FISH) Stabilní aberace (ale i dicentry) se kumulují s věkem, event.snížení reparačních schopností – nutno brát v úvahu u populačních studií

= biomarker expozice genotoxic.látkám Cytogenetická metoda = biomarker expozice genotoxic.látkám = biomarker účinků na člověka (predikce rizika nádorů) Prospektivní studie: CHA prediktivní pro riziko nádorů, nejsilnější asociace pro karcinom žaludku Cytogenetická metoda - použití jako skupinový expoziční test i k posouzení expozice jednotlivce

na zevní mutageny a karcinogeny ovlivňuje hladinu CHA Interindividuální variabilita v odpovědi na zevní mutageny a karcinogeny ovlivňuje hladinu CHA Genetické faktory metabolismus: aktivita enzymů, které přeměňují látku na ultimativní karcinogen, aktivita enzymů detoxifikačních polymorfismus enzymů – geneticky kontrolováno (polymorfismus genů) konfigurace chromatinu – strukturní vztahy ovlivňují možnost vzniku aberace (“hot spots”) schopnost reparačních mechanizmů opravovat DNA poškození-polymorfismus reparačních genů

Faktory ovlivňující hladinu CHA: Nedědičné – získaná vnímavost: Životní styl, kouření, výživa (mutageny/karcinogeny, antikarcinogeny ve výživě,alkohol), Kvalita prostředí – předchozí expozice, chronická expozice Věk + další

Expozice mutagenům/karcinogenům Životní prostředí: zplodiny průmyslových výrob zemědělství – pesticidy, hnojiva spalování fosilních paliv, odpadů emise spalovacích motorů … Výživa: mutageny/karcinogeny v potravě: vznik při nevhodné tepelné úpravě, skladování, kontaminanty potravin .. Profesionální expozice Životní styl : kouření, alkohol, opalování, automobilismus Léčba: chemoterapie, dg. a terapeut. dávky záření Endogenní vznik: NO, volné radikály, nitrosaminy,

Metabolismus genotoxických látek – individuální variabilita Fáze I : derivatizační: oxidace, redukce, hydrolýza - ↑hydrofility enzymy: monooxygenázy CYP450 = komplex enzymů, inducibilních, polymorfních Fáze II : konjugační – vznik konjugátů např s glutathionem enzymy: glutathion-S-transferáza (GST) glukuronyltransferáza sulfo-, acetyltransferázy … = enzymy inducibilní, polymorfní Cíl: přeměna lipofilních látek na polární sloučeniny, a jejich vyloučení z organizmu V procesu detoxikace - možné zvýšení mutagenity metabolitů (u tzv.nepřímých mutagenů - oxidační reakce→zvýšení reaktivity produktu)

Iniciačně promoční teorie vzniku nádorů Prokarcinogen Metabolic.aktivace enzymy I.fáze Ultimativní karcinogen Detoxikace enzymy II.fáze Iniciace 1-2 dny Promoce 10 let Progrese  1 rok v Normální buňka Iniciovaná buňka Preneoplastické buňky Nádor

Mutageny/karcinogeny ve výživě: látky vznikající při tepelné úpravě, skladování kontaminanty potravin přirozené složky potravy aditiva a ochucovadla

Deriváty základních nutričních faktorů: Mutageny/karcinogeny ve výživě Deriváty základních nutričních faktorů: Z bílkovin nevhodnou tepelnou úpravou – heterocyklické aminy (azaareny), např.IQ - přepalované maso - nitrosaminy, N-nitrososloučeniny (MNU), polyaminy- též endogenní vznik - PAU – polycyklické aromatické uhlovodíky Z lipidů – oxidované formy mastných kyselin… přívod lipidů → žluč.kyselin →sekundární žlučové kyseliny = stimulace proliferace střev.epitelu Pyrolýzou tuků → polycyklické aromatické uhlovodíky Ze sacharidů karamelizací → heterocyklické sloučeniny Z látek obsahujících škrob pečením, smažením → akrylamid Minerály – nitrozační reakce

Kontaminující látky: polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU), aromatické aminy, chlorované alifatické uhlovodíky, chlorhydriny, polychlorované dioxiny (přírozený vznik, nedokonalým spalováním org. látek – hoření lesů - kontaminace půdy, krmiva, živočiš.produktů), polychlorované bifenyly (PCB - průmyslově vyráběné), ftaláty (spalování fosilních paliv-ovzduší, z plast.hmot do potravin) nitrosaminy, dusičnany, Hg, Pb, As, Cd, Ni… mykotoxiny (aflatoxin, trichotecenové mykotox….)

Kontaminující látky: PAU - 65% v potravě jako kontaminanty obilovin, rostlinných olejů, listové zeleniny,ovoce - z ovzduší (spalovací motory, neúplné spalování org.látek) - 35% vznik při technologické úpravě – uzení, grilování masa nejzávažnější B(a)P – benzo(a)pyren – aterogenní změny cév, mutagen, karcinogen Nitrosaminy aj. N-nitrososloučeniny Vznik redukcí dusičnanů na dusitany a jejich nitrosací Endogenní nitrozace za účasti střevní mikroflory Exogenní vznik při výrobě piva, uzení masa, ryb tabák.kouř, výfuk.plyny nitrosace inhibována např. kys.askorbovou

Mykotoxiny = sekundární metabolity plísní –účinky hepatotoxické, neurotoxické, kardiotoxické, cytotoxické, imunotoxické, hemorrhagické, alergenní, imunosupresivní, mutagenní, karcinogenní Aflatoxin B1 – Aspergillus flavus, A.parasiticus cereálie, podzemnice olejná, ořechy, koření… hepatotoxický, prokázaný mutagen a karcinogen pro člověka- hepatocelulární karcinomy-hepatitida B zvyšuje riziko tu Ochratoxin - Aspergillus, Penicillium cereálie, luštěniny, mléko a vnitřnosti zvířat hepatotoxický, možný karcinogen pro člověka Patulin – Aspergillus, Penicillium jablka a další ovoce s hnědou hnilobou… susp.mutagen, teratogen

Přírodní mutageny/karcinogeny: Rostlinné fenoly – flavonoidy, třísloviny, antrachinony větš. příznivý účinek v nižších dávkách (antioxidanty, antikarcinogeny), některé ve vysokých dávkách karcinogenní př. flavonoid: quercetin, flavonoidy a třísloviny - ovoce, zelenina, luštěniny, léčivky, čaj, káva – denní příjem 1g/osobu – v tomto množství příznivý účinek antrachinony - léčivky, reveň, pohanka, aloe(aloe-emodin), třezalka (hypericin) antrachinonová barviva – potravinářství Hydraziny– v někt. jedlých houbách – vařením se ničí Aj.

Imunosupresiva: polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) polychlorovaní bifenyly (PCB) chlorované dioxiny, chlorované alifatické uhlovodíky org.sloučeniny cínu, Cd asbest benzen mykotoxiny

Příklady nutričních faktorů podílejících se na procesu karcinogeneze Iniciační faktory promoční faktory inhibiční faktory mykotoxiny vysoký energet.přívod vitaminy, C,E,A přirozené mutageny vysoký příjem tuků karotenoidy pyrolyzáty proteinů vysoký příjem solí rostl.fenoly PAU alkohol indoly aj. nitrosaminy selen

Nutriční ochranné faktory – prevence nádorových onemocnění Vitaminy – C, E, A, kys.listová ….. Minerální látky - Se, Ca, Mg, Zn Vláknina Přírodní antikarcinogeny – karoteny, karotenoidy (ß-karoten, lykopen) flavonoidy – hrozny, červené víno, zelenina, ovoce polyfenoly, polyfenolové kyseliny - kys.elagová, resveratrol, genistein, epigallokatechin gallát , kurkumin thioly: allyl sulfidy - česnek, cibule