Genotoxikologické metody seminář č.520 Vývoj

Klíčová slova: Genotoxicita, mutace spontánní a indukované, mutace somatické a gametické, mutace genové, chromozomové a genomové, substituce, delece, inzerce, posunová mutace (frame shift), missense mutace, nonsense mutace, elongační mutace, synonymní mutace, tranzice, transverze, mutagen, karcinogen, teratogen, ultimativní karcinogen, promutagen, prokarcinogen, nepřímý mutagen, addukt, iniciačně promoční teorie, zpětná (reverzní) mutace, Amesův test, auxotrofie, mikronukleus test, cytogenetická analýza, kometový test, sesterské chromatidové výměny

Experimentální organizmy Modely in vivo: Octomilka (Drosophila melanogaster) Myš (Mus musculus) Potkan (Rattus norvegicus) Drápatka (Xenopus laevis) Kur (Gallus gallus) Modely in vitro: Buněčné (tkáňové) kultury: a) trvalé buněčné linie (He La buňky) b) primokultury

Testování genotoxických účinků Testy in vitro: Amesův test – bakteriální Testy in vivo: Mikronukleus test Cytogenetická analýza buněk kostní dřeně exper. zvířete Cytogenetická analýza = sledování získaných chromozomálních aberací (zlomů a přestaveb) v kostní dřeni exper. zvířete, v lidských periferních lymfocytech Sesterské chromatidové výměny – BUdR metoda – výměny mezi sesterskými chromatidami Comet test – sledování zlomů DNA

Amesův test Mikrobiální metoda testování mutagenního účinku různých látek na bakteriálních kmenech Salmonella typhimurium (TA98, TA100, transgenní kmeny) V současnosti nejrozšířenější metoda pro skríning genotoxického působení Princip: indukce reverzních mutací

Princip Amesova testu Kmeny Salmonella typhimurium (TA98,TA100) nesou mutaci v genu pro syntézu histidinu Nejsou schopny tvořit histidin z dostupných živin; jsou auxotrofní - nerostou v mediu bez histidinu Pouze bakterie, které prodělaly reverzní (zpětnou) mutaci vytvoří kolonie

Schéma Amesova testu

Některé látky vyžadují tzv. metabolickou aktivaci = Některé látky vyžadují tzv.metabolickou aktivaci = nepřímé mutageny (jsou mutagenní až po přeměně enzymatickým systémem) – přidání S9 frakce jaterního homogenátu (příprava z jater potkanů vystavených směsi mutagenů) – obsahuje enzymy, které metabolizují testovanou látku

Vyhodnocení Amesova testu U bakterií, které vytvořily viditelné kolonie, musela proběhnout reverzní mutace genu nezbytného pro syntézu histidinu Zvýšení počtu kolonií ve srovnání s negativní kontrolou (bez mutagenu) je známkou mutagenního působení testované látky

Odečítání Amesova testu – obrazová analýza (Lucia)

Mikronukleus test Cytogenetická metoda testování mutagenního účinku různých látek - mikronukleus = chromozomální fragment, který zůstal mimo jádro, nebo celý chromozom Princip: stanovení frekvence mikrojader a) v erytrocytech kostní dřeně – u lab. zvířat b) v periferních lymfocytech – i u lidí (po zablokování cytokineze cytochalasinem) Výhoda: in vivo podmínky při testování na laboratorních zvířatech

Schéma mikronukleus testu

Mikronukleus v polychromatofilních erytrocytech http://faculty.ksu.edu.sa/al-saleh/Pages/LabAlbum.aspx

Mikrojádra v periferních lymfocytech: vpravo: mikronukleus v cytoplasmě dvoujaderné buňky po zablokování cytokinese cytochalasinem

Mikrojádra v periferních lymfocytech

Mikronukleus test - závěr Mutagenně působící látky vyvolávají změny v chromozomální výbavě buněk (zlomy) chromozomální fragment nebo celý chromozom, který se nezačlenil do dceřinného jádra tvoří mikrojádro Zvýšený počet mikrojader/1000 buněk ve srovnání s kontrolou je známkou mutagenního působení testované látky

„Comet assay“ – kometový test Metoda testující mutagenní účinky látek analýzou zlomů DNA Metoda založená na principu elektroforézy Odečítáme množství zlomů DNA Výhoda: sleduje aktuální stav poškození DNA ještě před reparací

Provedení „comet assay“ Aplikace testované látky laborator. zvířeti Usmrcení zvířete, odběr vzorků tkání (kostní dřeň, krev, játra aj.) Izolace buněk (trypsinizace) Lyze buněk buněk Rozpletení DNA v alkalickém roztoku Elektroforéza DNA v gelu na sklíčku Obarvení (ethidiumbromid); odečtení fragmentů DNA – „ohon komety“

Comet assay – odečítání (analýza obrazu)

Cytogenetická metoda - sledování frekvence chromozomálních aberací

Vyšetření lidských periferních lymfocytů Vystavení lidských periferních lymfocytů dárce in vitro testované látce v průběhu kultivace zpracování buněk cytogenetickou metodou (kolchicin, hypotonie, fixace), příprava preparátů, barvení a sledování počtu aberantních buněk, typů aberací Nebo u osob vystavených mutagenům (in vivo) – kultivace periferních lymfocytů – zpracování cytogenetickou metodou, barvení a hodnocení počtu aberantních buněk, typů aberací Hodnoceno 100-200 buněk

Postradiační chromozomální aberace difragment dicentr

Buňka silně poškozená chemickým mutagenem (chromatidové výměny)

Metoda sesterských chromatidových výměn (SCE) BUdR metoda – kultivace buněk v přítomnosti BUdR po dobu 2 cyklů dělení SCE= zlomy DNA a reciproké výměny DNA duplexů mezi sesterskými chromatidami, vznik v S fázi V 1. mitóze obě chromatidy tmavé V 2. mitóze - 1 chromatida tmavá, druhá světlá světlá = obě vlákna s BrdU-pomalejší spiralizace → světlejší zbarvení

+ BrdU po 2 cykly dělení –BrdU = analog tyminu První mitoza: Obě chromatidy stejně substituovány BrdU- tmavé 1. Druhá mitoza: jedna chromatida tmavá, druhá (s oběma vlákny substituovanými BrdU) světlá - zpoždění spiralizace = světlé zbarvení 2. b) sledování sesterských chromatidových výměn = metoda testování mutagenních účinků

Buňka neovlivněná mutagenem

Buňka ovlivněná mutagenem (zvýšený počet SCE)

Metody testování mutagenních účinků slouží k predikci karcinogenních účinků (jsou mnohem rychlejší než testy karcinogenity) Každý mutagen = potenciální karcinogen, ale jsou i negenotoxické karcinogeny

Nejpoužívanější modelové organismy lambda-bakteriofág, virus tabákové mozaiky bakterie Escherichia coli, Bacillus subtilis kvasinka Saccharomyces cerevisiae,pombe huseníček rolní (Arabidopsis thaliana), Zea mays háďátko řepné (Coenorhabditis elegans) Neurospora crassa Xenopus leavis octomilka obecná (Drosophila melanogaster) myš domácí (Mus musculus) potkan (Rattus norvegicus) pes (Canis lupus familiaris)

Modelové organismy Zea mays Tobacco mosaic virus Saccharomyces cerevisiae Arabidopsis thaliana Zea mays Bacillus subtilis

Modelové organismy Xenopus laevis – Drosophila melanogaster prezyg. a postzygotický vývoj Drosophila melanogaster Caenorhabditis elegans Schizosaccharomyces pombe

Modelové organismy Mus musculus, Rattus norvegicus Až 70% homologie lid. a myšího genomu Mutace stejného genu

Další zvířata, používaná jako LZ Druh LZ nejčastější použití Morče senzitivní k M. tuberculosis, nesyntetizuje C vit. Králík výroba očkovacích látek Prase domácí experimentální chirurgie, teratogeneze Ovce domácí výroba očkovacích látek, (beraní krev) Pes domácí výroba očkovacích látek, kontrola léčiv, experimentální chirurgie Kočka domácí kontrola léčiv Fretka virologie (vnímavost), kontrola léčiv Primáti model pro studium podobných znaků člověka Obojživelníci: studium ontogeneze, teratologie Drápatka, Axolotl, fyziologie, embryologie, genetika, toxikologie

Další zvířata, používaná jako LZ Druh LZ nejčastější použití Ptáci : - kontrola léčiv, fyziologie Kur domácí, zárodky, - teratologie, výroba očkovacích látek Křepelka japonská Holub domácí Ryby - hydrobiologie, kontrola čistoty vod testace krmiv, léčiv, ekotoxikologické hodnocení průmyslových odpadů

Nobelovy ceny a objevy na zvířatech 1901- Emil Adolf von Behring - metoda výroby léčivého séra z krve koní, kterým vstřikl do krve záškrtový jed. 1904 - Ivan Petrovič Pavlov práce a objevy v oblasti fyziologie zažívání (podmíněné reflexy) 1908- Paul Erlich  objev Salvarsanu – léku proti syfilidě. Ehrlich jej modifikoval a společně se svým spolupracovníkem S. Hatou vytvořil několik set přípravků pro testování na pokusných zvířatech. 1922 - Otto Fritz Meyerhof- na kvasnicových extraktech objev kyseliny adenozintrifosforečné. 1923 - Frederick Grant Banting a John James Richard Macleod - izolace příslušnho hormonu z pankreasu pokusných psů. Od té doby je možné léčit nemocné cukrovkou inzulínem. 1951- Max Theiler - nakazil žlutou zimnicí bílé myši a opice a tím vypěstovat oslabenou kulturu, tím vytvořil imunologické sérum proti žluté zimnici

Nobelovy ceny a objevy na zvířatech 1966 - Charles Brenton Huggins a Francis Peyton Rous na slepicích dokázali, že mnohé typy rakoviny zvířat způsobují viry 1975 - Renato Dulbecco a Howard Martin Temin a David Baltimore – na myších objev reverzní transkriptázy 1980 - Jean Dausset a George Denis Snell a Baruj Benacerraf na myších a morčatech objev histokompatibilních antigenů. 1981 - Torsten Niels Wiesela Roger W. Sperry a David Hunter Hubel - na kočkách specializace mozkových hemisfér 1982 - Sune Karl Bergström a Sir John Robert Vane a Bengt Ingemar Samuelsson - na králicích a prasatech výzkum prostaglandínů 1986 - Stanley Cohen a Rita Levi-Montalciniová na kuřatech a myších  objev epidermálního růstového faktoru (EGF).

Nobelovy ceny a objevy na zvířatech 1990 - Joseph E. Murray a Erwin Neher a   E. Donall Thomas a Bert Sakmann   na psech výzkum v oboru transplantace orgánů. 1995 - Christiane Nüssleinová-Volhardová a Eric F. Wieshaus a Edward B. Lewis na octomilce (D. melanogaster) objevy homeot. genů a tím také genetických mechanismů objasňujících vrozené vady. 2001 - Sir Paul M. Nurse a  R. Timothy (Tim) Hunt a  Leland H. Hartwell -  objevy klíčových regulátorů buněčného cyklu na kvasinkách. 2002 - Sydney Brenner a John E. Sulston a  H. Robert Horvitz na Caenorhabditis elegans objevy mRNA, apoptózy a genetické regulace vývoje orgánů.

Děkuji za pozornost