Dýchací řetězce – 2.část 4.ročník biochemie

Opakování …

Plastochinon – Menachinon - Ubichinon

(není součástí řetězce) Komplex II – E.coli Vyřešená struktura RTG analýzou v rozlišení 2,6 A Prof.Iwata a student Rob Horsefield Imperial College London Science, 299, 700 (2003) sukcinát SDH efektivněji odvádí e- z FADu = menší riziko vzniku ROS Baktérie používá za dostatečného přístupu O2 SDH přednostně než fumarát-DH + energeticky účinější - hromadění e- na FADu FAD 40 A Fe-S ubichinon Cytochrom b (není součástí řetězce)

Glycerol-3-fosfát dehydrogenasa Glycerol-3-fosfát dehydrogenasa z Leishmania mexicana Structure 8 pp. 541 (2000) * možný cíl pro terapie infekcí patogenními prvoky

Komplex III 3D struktura komplexu bc1 z kuřete P-strana * Konformační změny při transportu e- = přibližování center v řádu 20 A * Dimer = funkční spolupráce podjednotek, zvýšení katalytické účinnosti

Cytochrom c 'The Persistence of VisionTM Ray-Tracer software

Cytochrom c Cytochrom c (horse) * Periferální protein: vazba na P-straně membrány * Rozpustný x většina cytochromů * Asymetricky uložený hem – hrana cca 5A od povrchu proteinu - skupina lysinů pro interakci s cyt c1 a cyt c oxidasou Cytochrom c (horse) Cyt c je vysoce konzervován u všech druhů organismů člověk,šimpanz x makak 1AA člověk x kuře 13 AA malá molekula cca 12kDa výhodné pro studia evoluční divergence (fylogeneze)

3D struktura Cytochrom c cyt c oxidasa

(4 nejdůležitější podjednotky) Evoluce cyt c oxidasy Bakteriální enzym (4 nejdůležitější podjednotky) Živočišný enzym (13 podjednotek)

Terminální krok DŘ v aerobních podmínkách Sumární reakce 02 + 4 e- + 4 H+  2H2O Cytochrom c oxidasa = komplex IV (cytochrom aa3 oxidasa) - H+ pochází z N-strany x e- z P-strany = tvorba p - komplex IV je protonová pumpa - inhibice CN-, N3-, CO Důležité problémy: Jak jsou odebrány H+ z N-strany membrány ? Mechanismus redukce O2 na vodu ? Mechanismus spřažení redukce O2 s pumpováním protonů ?

Schéma podjednotek I a II cyt c oxidasy Reakční schéma pro polovinu molekuly O2 (vyžaduje vazbu 2 molekul cytochromu c) „kotvící doména“ pro vazbu cytochromu c (vzdálenost hem-CuA < 14A) stechiometrie 4H+/2e-/O z toho 2H+ přímo pumpou podjednotka I hemy podjednotka II

Mechanismus H+ - pumpy Baktérie Paraccocus denitrificans - nepozorovány žádné konformační změny (intermediáty?) Mitochondrie - konformační změna Asp na P-straně x ne ve všech MTCH - vyvrací mechanistické studie a mutagenese - nejpravděpodobnější „čerpací“ cesta : hem a3/CuB (role propionylových skupin na hemu?) Úloha D a K kanálů v přenosu H+ pro redukci kyslíku: - náznaky funkčního oddělení (D-kanál pumpa, K-kanál pro redukci O2 - mutagenese : vztah je složitější na 8 H+ pro redukci O2 (4 do molekuly H2O a 4 pumpovány): nejméně 6 D-kanálem /1-2 K-kanálem

Mechanistické schéma reakce cyt c oxidasy a 02 Tyr radikál ferric Postupný přenos e- z hemu a na hem a3 ferryl

Cyt c oxidasa

Struktura aktivního místa cyt c oxidasy Struktura s navázaným inhibitorem - CO

Celkový přenos H+ v komplexech III a IV * Rozdílné stechiometrie, redoxní rozsah, G * Tvorba stejného p

Transhydrogenasa NADH/ NADPH Redoxní páry NAD/NADH a NADP/NADPH: * Stejný Em,7 x velmi rozdílný poměr koncentrací v matrix (~500) * nerovnovaha udržována: 1) NADP-dependentní isocitrátdehydrogenasou 2) p-dep. transhydrogenasou nikotinamidových nukleotidů: NADP+ + NADH + nH+P-fáze  NADPH + NAD+ +nH+N-fáze Funkce (dlouho záhadou …) a) dodávka NADPH pro redukci glutathionu b) jemná kontrola TCA cyklu c) u některých parazitů – tvorba p (reverzní reakce)

Alternativní oxidasa Důležitá odlišnost MTCH rostlin, hub, řas a prvoků (homologní) - systematicky ubichinol-O2 oxidoreduktasa - přímý přenos e- z UQH2 na O2 bez komplexu III a IV - není inhibována CN- - inhibice SHAM (salicylhydroxamic acid) x ne antimycinem Funkce AOX: Produkce tepla - volatilizace aromat - růst při nízké teplotě 2) Oxidativní metabolismus bez syntézy ATP 3) Odčerpávání e- z UQH2 pro omezení produkce ROS ?

AOX Reakční mechanismus: zatím přesně neznámý „Di-iron centre“ (předp. cesta modrou)

Post-translační regulace aktivity AOX * aktivace redukcí disulfidového můstky na SH- skupiny

Přehled transportu e- v rostlinných MTCH

Bakteriální DŘ Specifika: a) Velká rozmanitost donorů a akceptorů b) Velká rozmanitost enzymových systému - mezi druhy i u jednoho organismu v závislosti na růstových podmínkách Příklady: Paracoccus denitrificans – půdní baktérie Escherichia coli – střevní baktérie (některé kmeny patogenní) Helicobacter pylori – baktérie žijící v žaludku Nitrobacter – půdní bakterie oxidující dusitany Thiobacillus ferroxidans – baktérie oxidující Fe a S v rudách Methanosarcima bacterii – metanogenní archebaktérie

Paracoccus denitrificans – přehled DŘ * Velmi rozvětvený DŘ – typické pro baktérie Akceptor H2O2 Akceptory při anaerobióze

P. denitrificans – růst na 1C-sloučeninách růst na MeOH, methylamin x nepříliš rozšířené u baktérií Krátký DŘ se speciálními proteiny: periplasmatické dehydrogenasy: a) MeDH – kofaktor PQQ b) MADH – kofaktor tryptofyl-tryptofan - amicyanin – 1e- přenašečový protein Redoxní pár MeOH/HCOH * stejný Em,7 jako sukcinát/fumarát * nižší stechiometrie H+/O Význam krátkého DŘ ? 1) oxidace HCOH na CO2 za tvorby NADH 2) inkorporace HCOH do syntetických drah PQQ

PQQ - kofaktor chinoproteinů Alkoholdehydrogenasa z baktérie Comomonas testosteroni

Model toku e- v chinohemoproteinu

P.denitrificans - oxidace MeOH a MEA (1C)

P. denitrificans – denitrifikace Anaerobní redukce NO3-  NO2-  NO  N2O (  N2 ) Nar - membránová NO3 reduktasa (translokace H+) * 2 hemy b, 1 atom Mo koordinovaným pterinovým kof. MGD Nap – periplasmatická NO3 reduktasa (nepřenáší H+) * 1 atom Mo, 2 kofaktory MGD * přenos e- z UQH2 přes NapC – 4 hemy c NiR – rozpustná periplasmatická nitritreduktasa * cytochrom cd1, příjímá e- také z pseudoazurinu NOR – membránová reduktasa NO (nepřenáší H+) * strukturní podobnost s oxidasami – NO jako předchůdce O2 N2O reduktasa - rozpustný periplasmatickýenzym stejný atom CuA jako komplex IV

Atom Mo v periplasmatické NR Model Mo centra v periplasmatické nitrátreduktase Paracoccus pantotrophus * 5 ligandů se sírou 4 pochází ze 2 pterinů 1 z Cys zbytku

P. denitrificans - Nap a Nar dráhy Vstup NO3- do buněk s negativním  NO3/NO2 antiport ?

P. denitrificans – denitrifikační enzymy Periplasmatický prostor

Paracoccus denitrificans – přehled DŘ * Velmi rozvětvený DŘ – typické pro baktérie Akceptor H2O2 Akceptory při anaerobióze

Escherichia coli Za aerobních podmínek: * 2 oxidasy: cyt bo3 a cyt bd * přímá oxidace UQ nebo MQ (chybí komplex bc1) * zkrácený DŘ = nižší stechiometrie H+/2e- ~ v prostředí dostatek substrátů – nezávislá na max. výtěžku Za anaerobních podmínek: * zastaven TCA cyklus (x Paracoccus) – produkce pyruvátu * přeměna Pyr na fumarát a HCOOH – jako donor/akceptor transportního řetězce a pro tvorbu p * řada alternativních akceptorů – NO3-, NO2-, DMSO, TMAO

Přehled aerobní a anaerobní respirace u E.coli

E.coli – cytochrome bo3 - translokace H+ současně pumpou a redox smyčkou Funkční podobnost s cytochromem aa3 X chybí atom CuA

E. coli - cytochrome bd - translokace H+ pouze redox smyčkou Sekvenční odlišnost od jiných oxidas + má 3 hemy !!

E.coli - oxidace formátu a tvorba p formát dehydrogenasa při anaerobních podmínkách UQ nahrazen menachinonem ! fumarát reduktasa

Vybrané bakteriální speciality * obecně mnoho podobnosti mezi baktériemi – viz E.coli, Paracoccus * sjednocující prvky: Chinony a cyt typu c jako mobilní komponenty DŘ Prostorová organizace komponent na membráně pro tvorbu p a) Gram-positivní (bez periplasmy) – silná vazba cyt c na membránu b) Obecné rozšíření NO reduktasy (i u baktérií bez denitrifikace!) c) Tvorba nerozpustných látek – redukce rozpustných Fe3+ solí na nerozpustné Fe2+ (Shewanella frigidimarina) d) Azotobacter, Klebsiella – oxidasy s vysokou afinitou k O2 – ochrana nitrogenasy citlivé na kyslík

Helicobacter pylori * Život při velmi nízkých konc. O2 – souvislost s vředy a rakovinou žaludku * Většina znalosti odvozena z analýzy genomu (1997, 1999): - jediná oxidasa (typ cbb3 – vysoká afinita pro O2) - nemá sukcinát dehydrogenasu !

H. pylori – přehled transportu e- jako u E.coli periplasma

Nitrobacter – „dusitan jako zdroj energie“ Růst na dusitanu - oxidace na NO3 (Em,7 = +420mV)!! * problém – jak získává NADH pro biosyntézu (Em,7 = -320mV)?? * řešením je reverzní tok elektronů Mechanismus (ne zcela odhalen …): 1) zkrácený DŘ jako u jiných bakterií * tok e- z NO2- na O2 ~ tvorba p, pohon ATPasy a transportu * nejasný přechod e- z NO2 na N-straně na cyt c (P-strana) hnací sílou  (obvykle u bakterií cca 170mV) Em,7 pro cyt c je o 150mV negativnější než NO2-/NO3- 2) p  reverze komplexů bc1 a NADH dehydrogenasy * reverzní tok e- z NO2- přes cyt c na NADH

Nitrobacter - reverzní transport e- Reverzní tok e- H+ pumpa

Thiobacillus ferooxidans oxidace Fe a anorganických sloučenin síry v rudách

Acidithiobacillus (syn. Thiobacillus) ferooxidans Růst na rudách - oxidace Fe2+ na Fe3+ (Em,7 = +780mV)!! * oxidace Fe2+ v periplasmě * elektrony přenos na rusticyanin – atom Cu chelatován 4 His * podmínky růstu – vnější pH ~ 2 1) rozpustnost - pomalejší neenzymová oxidace Fe2+ 2) pozitivnější Eh pro redukci O2 na H2O rusticyanin

Acidithiobacillus ferooxidans - transport e- Vysoký pH gradient je udržován membránovým potenciálem pH=2 pH=6 nepumpuje H+

Acidithiobacillus ferooxidans - transport e- Využití: „biohydrometalurgie“

Methanogenní baktérie Archebaktérie – výrazné odlišnosti ve struktuře i metabolismu Methanogenese – tvorba methanu je spojena s přenosem H+ a Na+

Methanogenní baktérie Velmi specifické kofaktory: * koenzym M … HSCH2CH2SO3- * koenzym B … HS(CH2)6-Thr fosfát * F420 … deazaflavin * F430 … corphyrin

Methanogenní baktérie Methanosarcima barkeri, M. mazei redukce methanolu: CH3OH + H2  CH4 + H20 chemismotická syntéza ATP a) protony jsou vynášeny ven přes membránu b) DCCD- inhibitor ATPasy snižuje p a produkci methanu c) protonofory dissipují p x zvýšení tvorby methanu 2) redukce CO2: CO2 + 4 H2  CH4 + 2 H2O

Reakce methanogenese 1 2 3 9 6 4 5

Translokace H+ podobný komplexu I Reakce methanogenese 2 8 7 Methyl CoM reduktasa F430 = porfinoid s atomem Ni v centru Membránový enzym Translokace H+ podobný komplexu I

Energetická bilance methanogenese Analýza jednotlivých kroků: k. 1) úvodní reakce H2  H+ za fyziol. koncentrací H2 endergonní - poháněna Na+ gradientem k. 6) přenos CH3- z pterinu na CoM exergonní - spřaženo s tvorbou Na+ gradientu - metanogenní baktérie vyžadují Na+ pro růst pro redukci CO2 vodíkem H2 G0´ = -131 kJ/mol - v bakteriální buňce G = - 30 KJ/mol - pro tvorbu ATP Gp = + 50 kJ/mol stechiometrie 0,6 ATP/molekulu CH4

Příště: Tvorba p u fotosyntézy