Prof. MUDr. Richard Průša, CSc. Apoptóza Prof. MUDr. Richard Průša, CSc. ÚKBP, 2.LF UK a FN Motol Určeno pro studenty 2. LF

Apoptóza - definice Velmi komplexní děj zahrnující několik metabolických drah a velkou skupinu signálních transdukčních proteinů, které společně vedou k řízené programované buněčné smrti. SMRT buňky: apoptóza – aponekróza – nekróza (nekróza – nekontrolovaná buněčná smrt se zánětlivou reakcí) Klíčem je IC obsah ATP, event. typ buňky

Předurčený zánik buňky Splněním dané úlohy Např. během embryogeneze, hormondependentní involuce (destrukce sliznice endometria v určité fázi menstruačního cyklu, atrezie ovariálních folikulů v menopauze, regrese laktační mléčné žlázy po skončení kojení, zánik thymocytů) Excesívní a. – Alzheimerova ch., Parkinsonova ch., diabetická retinopatie Insuficientní a. – nádorové bujení

Metabolické dráhy programované smrti 1. Vnitřní, mitochondriální dráha (souboj pro- a anti- apoptotických proteinů) – postupně tvorba komplexu cytochrom c/Apaf-1/kaspáza 9 = APOPTOSOM 2. Vnější, dráha membránového receptoru smrti (CD95 nebo TNF-R) – postupně tvorba komplexu s kaspázou 8 a 10 a s FADD = DISC Efektorové kaspázy 3, 6, 7 (řízená proteolýza) 3. Stresová dráha endoplasmatického retikula (kaspáza 12)

Společný most smrti Cysteinové proteázy (proteolýza): Kaspázy (cystein apsartyl-specific protease) Kalpainy (calcium-activated papain-like protease) Kathepsiny

Kalpainy (15) 14 genů pro velkou podjednotku, 2 geny pro malou podjednotku 8 splice variant pro kalpain 10 (10a-10h), 2 splice varianty pro kalpain 2 Typické – heterodimer z katalytické a regulační podjednotky, kalcium - nutné pro aktivaci Aktivní místo, cystein v pozici 115 (k.1), 105 (k.2)

Kaspázy 12 lidských kaspáz (1-10, 12, 14) Aktivní kaspáza je homodimer, 2 aktivní místa (kromě k.9) – cystein v pozici 285, vysoká homologie, rozdíly v aktivním místě – variabilita v substrátové specifitě: 1, 4, 5: tetrapeptid WEHD 2, 3, 7: tetrapeptid DEXD 6, 8, 9: tetrapeptid (L/V)EXD Iniciační (domény CARD, DED) x efektorové kaspázy

Cílové molekuly kaspáz (strukturní proteiny, kinasy a reparace DNA) Keratin 18 Lamin A, B Poly-ADP-ribosa-polymerasa (PARP) DNA-dependentní proteinkinasa U1-nukleoprotein Proteinkinasa C G-aktin, gelsolin, presenilin, fodrin

Regulace apoptózy Pro- apoptotické geny a proteiny Anti- apoptotické geny a proteiny Inhibitory apoptózy (IAP) Proteiny cytotoxických granul Antagonisté IAP

Pro- apoptotické proteiny BAK Bax Bcl-rambo Bcl-xs BOK/mtd BH3-only rodina Bcl-2 genů (Bad, BID, BIM, Bmf, BLK, Bik/Nbk, Noxa, PUMA (p53 upregulator of apopt.), Spike, BNIP3, Hrk/DP5)

Anti- apoptotické proteiny Bcl-2 Bcl-w Bcl-xES Bcl-xL Boo/DIVA Mcl-1 NR-13

Inhibitory apoptózy – cílem jsou kaspázy Apollon/BRUCE Survivin cIAP-1, cIAP-2 (cellular IAP) ILP-2 XIAP (X-linked IAP) NAIP Livin/KIAP/ML-IAP NF-kB

Proteiny cytotoxických granul Kalretikulin Kathepsin B, C Fas ligand/TNFSF6 Granulysin Perforin Serglycin Granzym A,B,C,D,E,F,G,H,K,M (serinové proteasy) Chemokiny(RANTES/CCL5, MIP-1a/CCL3 atd.)

Antagonisté IAP Smac/DIABLO (second mitochondria derived activator of a.) HtrA2/Omi

Laboratorní průkaz apoptózy Kaspázy- aktivita end point nebo živě v buěčných kulturách (množství fluoro/chromo-foru uvolněných/min na mg CB) Promega, Merck Biosc., Sigma-Aldrich, Santa Cruz Biotech., R+D Systems, Cambridge Biosc. Kaspázy - průtoková a laser-scanning cytometrie Kalpain – aktivita Kalpain, kaspázy – western blotting (produkty štěpení) Imunohistochemická detekce kalpainu a kaspáz

Laboratorní průkaz apoptózy Non-cystein proteasové markery apoptózy: Fosfatidylserin (flipázy) – anexin V Fragmentace DNA – ELISA, Laddering, TUNEL (3´konce DNA fragmentů) Signální proteiny: Fas, TNFR1, p53, proapoptotické Bcl-2 proteiny Mitochondriální markery: cytochrom c v cytoplasmě, m.membrán.potenciál, glutathion, GST (Nekróza: propidium iodid, LDH)

Metabolické dráhy programované smrti 1. Vnitřní, mitochondriální dráha (souboj pro- a anti- apoptotických proteinů) – postupně tvorba komplexu cytochrom c/Apaf-1/kaspáza 9 = APOPTOSOM 2. Vnější, dráha membránového receptoru smrti (CD95 nebo TNF-R) – postupně tvorba komplexu s kaspázou 8 a 10 a s FADD = DISC Efektorové kaspázy 3, 6, 7 (řízená proteolýza) 3. Stresová dráha endoplasmatického retikula (kaspáza 12)

Apoptóza Velmi komplexní děj zahrnující několik metabolických drah a velkou skupinu signálních transdukčních proteinů, které společně vedou k řízené programované buněčné smrti. SMRT buňky: apoptóza – aponekróza – nekróza (nekróza – nekontrolovaná buněčná smrt se zánětlivou reakcí) Klíčem je IC obsah ATP, event. typ buňky