Monitoring relapsu a minimální reziduální nemoci po transplantaci hematopoetických kmenových/progenitorových buněk Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, Ph.D. Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, 3.LF UK Sledování uspesnosti Tx z hlediska mozneho vzniku relapsu, který je nutny vcas zaznamenat, aby se zaclo brzo lecit a byla vetsi sance na uspech. Pro monitorovani pacientu je nutna identifikace molekularnich markeru onemocneni, které by poskytly casny systém varovani před relapsem.

Buněčný chimerismus po Tx imunologický jev, kdy buňky z geneticky rozdílných jedinců spoluexistují v jednom organizmu stav chimerismu ovlivňuje průběh potransplantačního období, četnost a závažnost GvHD a podíl relapsu sledování chimerismu k hodnocení úspěšnosti Tx, zjištění doby přihojení štěpu, stav vlastní a dárcovské krvetvorby Po Tx se tedy sleduje stav bunek, tzv. bunecny chimerismus. Kompletní chimerismus je obvykle spojený s nízkým rizikem relapsu a lepší prognózou.

Buněčný chimerismus po Tx Kompletní dárcovský chimerismus (donor chimerism, DC) původní krvetvorba příjemce je kompletně nahrazena dárcovskou krvetvorbou nízké riziko relapsu a lepší prognóza Smíšený chimerismus (mixed chimerism, MC) původní krvetvorba příjemce v lymfohematopoetických tkáních koexistuje s krvetvorbou dárce

Smíšený chimerismus přetrvávání původní krvetvorby zvyšuje riziko relapsu u leukemie často předvídá relaps přechodný, stabilní – nižší riziko relapsu progresivní – zvyšuje se podíl pacientovy krvetvorby, může být indikátorem relapsu častý u nemaligních onemocnění bez myeloablativního přípravného režimu, známkou klinického zlepšení onemocnění detekce původu buněk periferní krve/kostní dřeně → vyšetření vysoce polymorfních repetitivních sekvencí v lidském genomu pomocí PCR (variable number of tandem repeats – VNTR) první odběry periferní krve 14 a 28 dní po transplantaci a dále v měsíčních intervalech léčba podáním DLI (donor lymphocyte infusion) – riziko GvHD! Přetrvávání příjemcovy hematopoézy zesiluje riziko relapsu, který je hlavní příčinou úmrtnosti po alogenní transplantaci hematopoetických kmenových buněk. Na druhé straně, mohou existovat situace, kdy smíšený chimerismus může být výhodnější než kompletní dárcovský chimerismus. Tady mohou být imunologické výhody stavu smíšeného chimerismu v tak různorodých situacích jako jsou orgánové transplantace, vrozené poruchy metabolismu a imunoterapie solidních nádorů. Sledování chimerismu nám může tedy pomoci hodnotit úspěšnost transplantace, a to především ve smyslu zjištění doby přihojení štěpu průkazem jeho aktivity. V průběhu potransplantačního období nás informuje o stavu vlastní i dárcovské krvetvorby.

Stanovení genotypů polymorfních a sex specifických lokusů DNA pro vyšetření buněčného chimerizmu po HSCT (ÚHKT, Praha) → odběr primárních vzorků nesrážlivé periferní krve a kostní dřeně, bukální sliznice či nehtů k získání DNA pro účely: zjištění informativity tj. výběr polymorfních lokusů DNA, které se budou u pacienta po alogenní HSCT vyšetřovat odběr periferní krve (5 - 10 ml) pacientovi před Tx a jeho dárci odběr vzorku neobsahující krevní, či krvetvornou tkáň (stěr buněk vnitřní strany dutiny ústní - bukální sliznice, či nehty) po Tx monitoring chimérizmu u pacienta po alogenní HSCT odběr periferní krve (5 - 10 ml) a/nebo kostní dřeně (2 – 5 ml) v dohodnutém časovém sledu pacientovi (minimálně 1.5 x 106 leukocytů/ml) Primární vzorky periferní krve (5 - 10 ml) se odebírají pacientovi před alHSCT a jeho dárci. Je žádoucí provést odběr ve stavu dostatečné buněčnosti krve pacienta, tj. ještě před zahájením přípravného režimu transplantace. V případě, že nebylo možné zajistit vyšetření informativity u pacienta před alHSCT, odebere se pacientovi po alHSCT primární vzorek, který neobsahuje krevní, či krvetvornou tkáň (stěr buněk vnitřní strany dutiny ústní - bukální sliznice, či nehty). Pokud nebylo možné zajistit vyšetření informativity u dárce (u nepříbuzných dárců z ciziny, když nebyl zaslán primární vzorek periferní krve), primární vzorek dárce pro vyšetření informativity pak nahrazuje výplach transplantačního vaku obsahujícího zbytky převáděných hematopoetických kmenových buněk. Nutným předpokladem úspěšného vyšetření primárního vzorku je přítomnost dostatečného množství jaderných buněk.

Vyšetření potransplantačního chimérizmu v molekulárně biologické laboratoři VNTR vyšetření hypervariabilních regionů MCT-118, APO-B, YNZ-22, apod. pomocí jednokolové PCR a relativní kvantifikace zastoupení příjemcovy a dárcovské krvetvorby na základě předem připravených dilučních řad Sex/mismatch - vyšetření genu pro amelogenin, SRY apod. v případě dárkyně ženy a příjemce muže a nepřínosnosti výše uvedeného vyšetření The gene for amelogenin can be used in sex determination of samples from unknown human origin through PCR. Gen na chromozomu X ma jen 106 bp, zatimco gen na chromozomu Y ma 112 bp. Agarosove elfo v pripade zeny XX ukaze pouze jeden band, zatimco u muze XY 2 bendy. The highly polymorphic D1S80 (MCT118) locus has no known genetic function. However, this variable number of tandem repeats (VNTR) locus has been highly valuable in forensic identification. Apo-B apolipoprotein B

Minimální reziduální nemoc přítomnost nádorových buněk v organismu v množství nedetekovatelném konvenčními metodami, tedy v období kompletní remise konvenční metody: cytologie, histologie, konvenční průtoková cytometrie MRN v průběhu nebo po ukončení protinádorové terapie detekce ke včasnému podchycení možného vzniku relapsu morfologická detekce asi 5% nádorových buněk důležitá detekce ve štěpech pro autoTx nutné zjištění odlišnosti nádorové buňky od normální podrobné vyšetření: imunologické, cytogenetické a molekulárně biologické → průkaz specifickými metodami v době remise po chemoterapii možná změna imunofenotypu buňky → falešná negativita po chemoterapii imitace CALLA+ ALL, do dřeně vyplaveny buňky CD10+, CD19+, HLA DR+ O MRN se mluví zpravidla v průběhu nebo po ukončení protinádorové terapie. podrobné vyšetření nádorové buňky zdánlivě neprinese nic noveho ke zprasneni diagnozy, ale prinosem pro pozdejsi detekci MRN, která je zalozena na detekci odlisnosti nadorove bunky od normalni.

Metody detekce MRN dostatečná specifita a senzitivita 1. imunologické metody průkaz „relativní specifity“ – určení imunofenotypu nevyskytujícího se ve zkoumané tkáni Leukemie/lymfom % záchytu Senzitivita Imunofenotypy pre-B ALL 50-60 10-2 - 10-4 CD19/CD13, CD19/CD33, TdT/cIg, TdT/mIg T ALL/NHL 90-95 10-4 - 10-5 TdT/cCD3, TdT/CD5, TdT/CD1, cCD3/CD10, cCD3/CD11b, CCD3/CD13, CD7/CD10, CD7/CD11b, CD7/CD13 B NHL > 90 10-2 k/CD20, l/CD20 AML CD13/CD7, CD13/CD19, CD13/TdT, CD33/CD7, CD33/CD19, CD33/TdT, CD34/CD9 určení imunofenotypu nevyskytujícího se ve zkoumané tkáni = napr. Bunky vyskytujici se za fyzilogickych podminke pouze v thymu jsou nalezeny v KD, kde svedci o infiltraci nadorovymi bunkami Tab= prehled detekce MRN u leukemii a lymfomu. Metoda musí byt dostatecne specificka a citliva, aby umoznila detekce nadorove bunky ve velkem mnozstvi zdravych bunek. TdT= enzym terminalni deoxynukleotidyltransferaza Eckschlager, Průtoková cytometrie v klinické praxi, 1999

Metody detekce MRN 2. molekulárně-biologické metody kvantitativní RT-PCR analýza leukemických fúzních genů detekce klonálně-specifických přestaveb genů pro Ig/TCR CML detekce Bcr-Abl fúzních transkriptů – 1 buňka v milionu zdravých PCR pozitivita do 9 měsíců po Tx, obvykle do negativity, u pacientů se štěpem bez T lymfo rizikem PCR pozitivita po roce po Tx – vysoké riziko relapsu DLI účinně indukuje molekulární remisi Casna pozitivita u pacientu s nemanipulovanym stepem se obvykle zmeni v negativitu. Ale u pacientu, kteří obdrzeli step bez T lymfo, muze byt pozitivni vysledek rizikem, protože beznou strategii v lecbe MRN je podani DLI. Pozdni pozitivita rizikem u obou Tx.

Metody detekce MRN Akutní leukémie imunofenotypizace (viz. tabulka) PCR – chromozomální aberace – klonální přestavby Ig/TCR normální lymfoidní buňky obrovská variabilita v uspořádání řetězců imunoglobulinů a TCR X klon leukemických buněk ponese stejné Ig/TCR

Citlivost metod k detekci MRN Metoda Citlivost Podstata morfologie 1 : 100 morfologické odlišnosti nádorové buňky konvenční cytogenetika průkaz specifické chromozomální aberace Southern blot průkaz specifické sekvence DNA - chromozomální aberace nebo mutace FISH 1 : 1000 průkaz specifické sekvence DNA - chromozomální aberace imunologické metody 1 : 10000 průkaz pro nádor specifického antigenu nebo kombinace antigenů PCR 1 : 100000 RT-PCR průkaz specifické sekvence RNA - chromozomální aberace nebo mutace Eckschlager, Průtoková cytometrie v klinické praxi, 1999

Leukemický relaps po Tx Závislost na: typ a stav onemocnění v době Tx přípravný režim GvHD profylaxe Metody k předpovědi relapsu → detekce minimální reziduální nemoci, časné varování a terapeutický zásah Ačkoliv je alogenní Tx úspěšnou léčbou u pacientu s hematologickými malignitami, často se objevuje leukemicky relaps zavisející na typu a stavu onemocneni v době Tx…metody k predpovedi relapsu by umoznily casny zasah a umoznily by tak zachranu mnoha pacientu a zlepseni pravdepodobnosti dlouhodobeho preziti bez znamek onemocneni

Relaps cytogenetický nebo molekulární relaps detekce abnormalit pomocí technik cytogenetiky, blottingu, PCR nemusí nutně indikovat klinický relaps, ale může předvídat b) patologický relaps mikroskopický průkaz návratu onemocnění c) klinický relaps jasné klinické příznaky návratu onemocnění

Léčebný postup u relapsu po Tx prognóza a odpověď na další léčbu obecně koreluje s délkou remise někteří pacienti dosáhnou kompletní remise značná toxicita další léčby, zvláště pokud druhá Tx

Léčebný postup u relapsu po Tx Možnosti terapie chemoterapie (ne agresivní u relapsů do D+100) imunoterapie (IFN-a, IL-2, G-CSF, DLI, zastavení imunosuprese) druhá Tx: ne pokud relaps v prvním roce po Tx přípravný režim: už ne TBI, pokud byl výběr alternativního dárce (druhý sourozenec): důraz na GvL efekt minimalizace GvHD profylaxe – podpora GvL efektu, štěp s obsahem T lymfocytů