Evoluce proteinů Úloha domén Alice Skoumalová

Definice domény Nezávislá strukturální, funkční a evoluční jednotka proteinů Strukturální (kompaktní úsek terciální struktury) Sama zaujímá terciární strukturu a stabilizuje se Kombinace motivů α-helix a β-skládaného listu Většina proteinů má 2 a více domén 2. Funkční (různé funkce) Př. vázání ligandů, průchod membránou, obsahují katalytické místo, vázaní DNA, vazba na jiný protein Může být funkčně nezávislá nebo se zapojit do fungování dalších domén 3. Evoluční (příbuznost) Přítomnost stejných domén v proteinech ukazuje na jejich příbuznost (vznik „nadrodin“) - rodokmen Existuje „klasifikace proteinů na podkladě struktury“ (1200 nadrodin)

Tvorba nových proteinů Duplikace, divergence a kombinování stávajících domén, jejichž funkce je již prověřena 98% domén u lidí je duplikováno duplikace - nová funkce (v důsledku změny struktury či spolupráce se sousedícími doménami) Tento mechanismus umožňuje vytvořit nový protein z domén pocházejících z různých proteinů Mutace přispívají k vývoji proteinů a vzniku nových funkcí. Tento vývoj je ale urychlen duplikací, divergencí a kombinováním domén. Duplikace domén je velmi rozšířena.

Kombinování domén Domény v různých proteinech mohou mít: Stejnou funkci, ale v jiném kontextu Syntaktický posun Novou funkci v důsledku divergence Sémantický posun

Transkripční faktor FadR Lidská methionin aminopeptidasa WHD Oligomerizační/CoA-vázající doména Kreatinasova/aminopeptidasova doména Restrikční endonukleasa Fokl WHD (Winged helix domain) Transkripční faktory řídí transkripci DNA. Většina z nich obsahuje opakující se motiv-Winged helix domain. Je to doména, jejíž funkce je vázat se na DNA. U transkripčních faktorů se její funkce kombinuje se senzorickými či regulačními doménami. WHD doména se vyskytuje ve všech proteinech, které se vážou na DNA. Můžeme ji najít také v enzymech, např. v enzymu restrikční endonukleasa. Restrikční endonukleasy štěpí DNA. U restrikční endonukleasy Fokl WHD doména spolupracuje s katalytickou doménou. Zde je vidět příklad syntaktického posunu WHD domény. U obou proteinů má tu samou funkci (nasměrovat protein na určitou sekvenci DNAa navázat se), ale výsledná akce obou proteinů je jiná, protože v každém WHD doména spolupracuje s jinými doménami. Sémantický posun WHD domény můžeme vidět u aminopeptidasy. Aminopeptidasy štěpí peptidy od koncových aminoskupin (na rozdíl od karboxypeptidas). WHD doména u lidské methionin aminopeptidasy nemá funkci vázání na DNA, ale úplně jinou. Tvoří kapsu pro specifický substrát. WHD Katalytická doména

Příklad výstavby nových proteinů pomocí kombinování domén Proteiny účastnící se hemostasy nadrodina příbuzných proteinů společný ancestrální protein s trypsinem (doména homologická trypsinu) vytvoření rodokmenu za použití 7 modulů

Předchůdce všech dalších proteinů Ancestrální protein Trypsinu-podobná serinová proteinasa P Modul kódující strukturu označovanou jako kringle přídání kringlu K P Předchůdce všech dalších proteinů Vycházíme z ancestrálního proteinu, kterým zřejmě byla trypsinu podobná serinová proteinasa. Přidáním modulu, který kóduje strukturu ounačovanou jako kringle, protože svým tvarem připomíná dánský preclík tohoto jména, dostaneme „prarodiče“ všech dalších proteinů.

Urokinasa t-PA Faktor XII P přidání domény EGF K P E K P přidání fibronektinové domény 2 F2 E K P přidání fibronektinové domény 1 duplikace kringlu F1 F2 E K P Nejdříve budeme sledovat levou větev. Připojením modulu z epidermálního růstového faktoru, dostaneme základ struktury urokinasy. Enzym urokinasa byla nalezena v lidské moči, proto ten název. Ale vyskytuje se mimo jiné i v krvi, její funkce je aktivace plazminogenu. Po přidání jedné domény fibronektinu F2 dostaneme prekursor, u něhož vede duplikace kringlu ke vzniku struktury t-PA (tkáňový aktivátor plasminogenu). Jestliže k uvedenému prekurzoru přidáme další fibronektinovou doménu F1 a proběhne duplikace domény EGF, dostaneme stukturu faktoru XII. Fibronektin-glykoprotein. Váže se na receptorové proteiny či na proteiny extracelulární matrix. Náchází se i v plasmě ve formě dimeru. Má mnoho isoforem, které jsou skládány ze 3 domén I, II, III. EGF je růstový faktor, váže se na receptor na buňkách a spouší signální transdukční kaskádovou reakci, která vede k nárustu vápníku, glykolysy, proteosyntesy, expresy některých genů (DNA syntesa a proliferace buněk). F2 E K K P duplikace domény EGF t-PA F1 E F2 E K P Faktor XII

Faktory VII, IX, X Protein C přidání propeptidu Urokinasa E K P K P Pr přidání domény vázající vápník F2 E K P C K P Pr duplikace kringlu delece kringlu Pr C P F1 F2 E K P Další větev rozvíjení prarodiče KP spočívá v připojení propeptidu Pr a domény vázající vápník C. Dostaneme prekurzor PrCKP, z něhož duplikací kringlu dostaneme strukturu prothrombinu (aktivací vzniká trombin). Jesltiže naopak nastane delece kringlu, dostaneme mezistupeň PrCP, k němuž se opakovaně přidají domény EGF a dostaneme základ struktury faktorů VII, IX, X a proteinu C. Protein C je plasmatický protein, sktivovaný trombinem, degraduje fakrory Va a VIIIa a tím inhibuje produkci trombinu. Protrombin je glykoprotein. Je tvořen 2 částmi: fragment F1+2 a prethrombin. Účinkem faktoru Xa se rozštěpí na rozhraní těchto dvou částí a potom se ještě rozštěpí v oblasti pretrombinu. Vznikne dvouřetězcová aktivní molekula thrombinu a F1+2. První část fragmentu F1+2 se označuje Gla, což znamená zvýšený výslkyt γ-karboxyglutamátu (vzniká posttranslační karboxylací glutamátových zbytků), který umožňuje vázat vápenaté ionty. přidání 2 domén EGF C K K P Pr F2 E K K P Prothrombin t-PA C E E Pr P Faktory VII, IX, X Protein C F1 E F2 E K P Faktor XII

Růstový faktor hepatocytů opakovaná duplikace kringlu Urokinasa E K P K P Pr Růstový faktor hepatocytů F2 E K P K K K K P C K P Pr duplikace kringlu K K K K K P Pr C P F1 F2 E K P Plasminogen Relativně nejjednodušší způsob rozvíjení prarodiče KP se dá uskutečnit opakovanou duplikací kringlu. Protein se 4 kringly je růstový faktor hepatocytů, 5 kringlů obsahuje plasminogen a okolo 40 kringlů má apolipoprotein (a). Růstové faktory jsou proteiny, stimulují buněčnou proliferaci a diferenciaci. Jsou to signální molekuly, vážou se na recep¨tory na povrchu buněk a spouští kaskádu dalších reakcí. Plasminogen je protein nacházející se v plasmě, aktivován na plasmin a spuští se proces fibrinolysy. Apolipoprotein (a) je glykoprotein homologní s plasminogenem. Jeho zvýšená koncentrace je rizikový fasktor. C K K P Pr F2 E K K P Prothrombin K K K K K K P t-PA C E E Pr P Apolipoprotein (a) Obsahuje okolo 40 kringlů Faktory VII, IX, X Protein C F1 E F2 E K P Faktor XII

Na příkladu výstavby nových proteinů účastnících se koagulace vidíme: Výklad příbuznosti krevních proteinů je vyjádřením obecného principu vytváření funkcí na úrovni proteinů Jednoduché aritmetické operace s genovými moduly umožňují vznik nových proteinů s odlišnými vlastnostmi

Souhrn Duplikace, divergence a kombinování domén je zásadní pro vznik nových proteinů K vytvoření nových proteinů a funkcí není třeba úplně nových genů Množství informace obsažené v proteinech roste za konstantního množství informace genetické Příklad příbuznosti na proteinech zapojených do hemostasy

2. Proteomika

Vědecký obor studující proteiny Co je to proteomika? Vědecký obor studující proteiny Proteomika Genomika PROTEin+genOME Exprese Genom Proteom +posttranslační modifikace +alternativní sestřih +alternativní zavinutí Souhrn všech proteinů v daném organismu Lidské tělo obsahuje miliony proteinů Exprese proteinů v rámci jednoho organismu se liší Souhrn všech genů v daném organismu Lidský genom obsahuje 20-25.000 genů Genom je konstantní celek

Nárůst diverzity proteinů Posttranslační modifikace Alternativní sestřih Alternativní zavinutí Primární transkript - mRNA před posttranskripční modifikací Alternativní sestřih Posttranslační modifikace Alternativní zavinutí

Posttranslační modifikace Chemická modifikace proteinů po translaci Připojení funkčních skupin (acetát, fosfát, lipidy, cukry) Modifikace amino skupin (karboxyglutamát, hydroxyprolin) Strukturní změny (tvorba disulfidických vazeb, proteolytické štěpení)

Alternativní sestřih Z primárního transkriptu (1 genu) vzniká více mRNA a tedy více různých proteinů There are four known modes of alternative splicing: Alternative selection of promoters: this is the only method of splicing which can produce an alternative N-terminus domain in proteins. In this case, different sets of promoters can be spliced with certain sets of other exons. Alternative selection of cleavage/polyadenylation sites: this is the only method of splicing which can produce an alternative C-terminus domain in proteins. In this case, different sets of polyadenylation sites can be spliced with the other exons. Intron retaining mode: in this case, instead of splicing out an intron, the intron is retained in the mRNA transcript. However, the intron must be properly encoding for amino acids. The intron's code must be properly expressible, otherwise a stop codon or a shift in the reading frame will cause the protein to be non-functional. Exon cassette mode: in this case, certain exons are spliced out to alter the sequence of amino acids in the expressed protein.

Alternativní zavinutí Protein se zavinuje tak, aby byla co nejmenší jeho volná energie Existuje však několik alternativních konformací Lokální minima (alternativní konformace) Globální minimum (nativní stav)

Základní schéma analýzy užívané v proteomice Směs proteinů 1. Separace 2D-PAGE Jednotlivé proteiny 2. Izolace Štěpení trypsinem Peptidy 3. Hmotnostní analýza Hmotnostní spekroskopie (MALDI-TOF) 4. Sekvenční analýza Fragmentace peptidů Hmotnostní spektra peptidů Sekvence peptidů 5. Porovnání s databází Identifikace proteinů

2D gelová elektroforéza Rozdělí současně stovky i tisíce proteinů Proteiny jsou rozprostřeny na ploše

Aplikace proteomiky v medicíně (proteomika nemocí) Úloha proteinů ve vzniku nemocí Exprese proteinů u nemocí Detekce proteinů vznikajících během nemoci je využita k diagnóze Alzheimerova choroba (amyloid β) Srdeční onemocnění (interleukin-6 a 8, sérový amyloid A, fibrinogen, troponiny) Renální buněční karcinom (karbonanhydrasa IX) Biomarkery nemocí Proteiny hrají centrální úlohu v životě organismu. Informace o proteinech způsobující onemocnění je využita pro vývoj nových léků 1. Známá 3D struktura proteinu-počítačová simulace-hledání léku, který inhibuje patologický protein (HIV-1 proteasa) 2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-odlišný proteom-vývoj individuálních léků Vývoj nových léků

Plasmatické biomarkery u AD Biomarkery nemocí Plasmatické biomarkery u AD Diagnóza AD Klinické projevy+post mortem (histologie) Není žádný spolehlivý diagnostický test (cerebrospinální tekutina- CSF se špatně získává) Periferní krev Asi 500 ml CSF je absorbováno do krve každý den Plasma by mohla být zdroj biomarkerů Identifikace diagnostických biomarkerů v periferní krvi za pomocí proteomiky: Vzorky krve pacientů s AD a kontrol byly analyzovány za pomocí 2D gelové elektroforézy Byly identifikovány body, které se lišily u pacientů a kontrol Tyto proteiny byly analyzovány pomocí hmotnostní spektroskopie

Výsledek 15 bodů signifikantně odlišných u nemocných a kontrol Analýza pomocí MS: např. 2 makroglobulin, komplement faktor H

Virtual ligand screening Vývoj nových léků Virtual ligand screening HIV 1-proteasa: Štěpí HIV protein na menší funkční proteiny; virus nepřežije bez tohoto enzymu (nejvýznamnější cíl léčby HIV)

Souhrn Proteomika studuje proteiny, hlavně jejich strukturu, funkci a interakce Genom byl již zmapován, nyní je na řadě proteom (miliony proteinů) Metod, které proteomika využívá je velké množství, mezi základní patří 2D gelová elektroforéza a hmotnostní spektroskopie Proteiny určují fungování organismu a jejich patologie spouští nemoci; proto je proteomika zásadní pro zjišťování příčin chorob, diagnózu a léčbu

Otázky Definice proteinové domény, mechanismy tvorby nových proteinů pomocí kombinování domén, pojem syntaktický a sémantický posun Mechanismy nárůstu diverzity proteinů v porovnání s geny (3) Schéma pokusu pro identifikaci rozdílů v proteinové expresi u nediferencovaných a diferencovaných neurálních buněk Způsob použití softwaru pro vývoj nových léků